【Like a PRO應用專輯】SNP檢測方法一本通
SNP (單核苷酸多態性, single nucleotide polymorphism) 為人類可遺傳變異中最常見的一種，佔所有已知多態性的 90% 以上。SNPs 廣泛存於生物基因組中，人類基因組中預估就有 300 萬組以上，近年來備受遺傳分析研究者們的關注。
由於 SNPs 的二態性特質(即二等位基因，biallelic)，在基因篩選中常只需作 +/- 分析，不用分析片段長度，有利於發展自動化、高通量的篩選方法，成為有用標記手段。
SNPs 標記技術除了人類及動動基因分型應用外，也開始應用植物上，目前在水稻、玉米、大豆陸續有文獻發表，有助於揭示作物生長發育規律。以 SNPs 為核心的高通量基因分型技術的發展，極大地推動了農作物在遺傳、種質鑒定和功能基因的克隆與鑒定、分子育種等方面的研究。
本篇【Like a PRO專輯】將著重在可應用於 Microplate Reader 的 SNPs 基因分型技術，有效發揮 Reader 的高通量及易用性，包括：
1． KASP 法 (競爭性等位基因特異 PCR, Kompetitive Allele Specific PCR）
可在廣泛的基因組 DNA 樣品中，甚至是一些複雜基因組樣品。可對 SNPs 和特定位點上的 Ins/Del (插入和缺失)進行精準的雙等位基因判斷。KASP 技術的特色為具有極高的檢測穩定性和精確性且節省大量實驗成本。
2． TagMan 探針法
基於 Taq DNA 聚合酶的 5′-核酸酶活性，可通過 real-time PCR 進行分析，，優化的反應條件結合多色標記甚至能在一個反應裡檢測多達 7 種不同的 SNPs)。
3． Invader SNP 基因分型
Invader 測定原理基於等位基因特異性探針與 Invader 寡核苷酸一起在 SNP 位點發生重疊並形成一個 invader 三維結構，此結構可被 FEN 裂解酶所識別。等位基因特異性探針連接的螢光染料從淬滅序列中分離出來，產生螢光信號。儘管此技術具有很高的可靠性且開發出了多色系統，允許同時檢測 20 個以上的 SNPs 分型，但若想應用到高通量平臺依然有一定限制。
4． Amplifluor SNPs HT 基因分型技術
實驗包含兩種 Amplifluor SNPs 引子和三種非標記引子，相對於KASP，可節省 10-20 倍的成本。此外，研究者可以更加靈活的設計、測試、重新設計和分析 SNP 引子。
5． Molecular Beacons SNPs
基因分型技術與它們的特異性目標序列雜交，導致髮夾結構打開將 5'末端的報告基團和 3'末端的淬滅分子分開，最終產生出螢光信號。信號強度與目標 DNA 含量成正比。
專輯中並列舉幾種常見方法的實例，如 KASP 方法
樣品一般可放於多孔板中如 96 孔板，非常適合在具有螢光檢測功能的 reader 上進行螢光信號的讀取，下圖為 KASP 樣品產生的螢光信號在 SpectraMax i3x 和 SpectraMax M5e 讀取後所繪製的散點圖：
FAM、HEX 和兩者的混合物的相對螢光強度與 ROX 進行標準化且標準化值在 SoftMax Pro 軟體中繪製散點圖。如圖所示，得到了三個不同的集群。
ROX 標準化的 DNA 擴增樣品螢光在 SoftMax Pro 軟體中繪製散點圖。三個顯著的集群被檢測出來。FAM 純合子位置靠近 X 軸，而 HEX 純合子則位置靠近 Y 軸，包含 FAM 和 HEX 的雜合樣品所形成的的集群在兩個純合子集群之間。無範本對照形成的集群靠近座標0點位置。所得資料與供應商驗證試劑盒基因分型結果高度一致。
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