Molecular Devices

      【前言】 　　『細胞信息傳遞路徑』的概念從80年代被提出，解釋細胞外的分子訊號經細胞膜傳入胞內後，一系列促酶（磷酸化、泛素化等）的反應路徑，改變路徑中蛋白的結構的過程。 　　一般情況下，膽固醇等脂質可直接穿透脂雙層細胞膜進入細胞，但訊號分子是多肽類（如生長因子、細胞因子、激素、神經傳遞物質以及其它小分子化合物等），只能先與胞膜上的受體蛋白（通常為穿膜蛋白transmembrane protein）或稱為配體（adaptor）結合後，再啟動下游一系列反應。 　　 諾貝爾獎獲得者David Baltimore（圖1）于1986年發現的NF-κB，是從B淋巴細胞的細胞核萃取物中找到的轉錄因子。NF是細胞核因子，κB命名是因為它能與免疫球蛋白kappa輕鏈基因的擴增子B序列特異性結合，促進κ輕鏈基因表達。其本身是一種蛋白質複合物，能夠調控轉錄的DNA、細胞因子的產生以及細胞存活 [1] 。 　　 NF-κB 在細胞訊息傳遞領域中具有舉足輕重的地位，已知 NF-κB 參與細胞對刺激的反應，如自由基、重金屬、紫外線照射、氧化LDL和細菌或病毒抗原等。如果出現調節異常，會引起發炎反應、自體免疫疾病、感染性休克、細胞增生/分化/凋亡的紊亂。 目前大家熟知 NF-κB 在天然免疫機制中發揮著非常重要作用，也有很多文章研究發現NF-κB是發炎和癌症之間的重要關鍵。最近的一篇文章研究發現，酒精和其他濫用藥物可誘導大腦中的 NF-κB 活性和細胞因子表達，認為 NF-κB 和『 酒精及藥物成癮』 可能存在聯繫 [2] 。 【NF-κB檢測實務】 由於NF-κB是轉錄因子，它的活性主要作用在兩方面：DNA結合活性和反式啟動活性 1. 檢測其結合活性最經典的方法是EMSA 2. 反式啟動能力檢測方式則以NF-kB的報導基因測定較為理想。 其他已開發的『 NF-κB訊號通路檢測方法 』還有，Western Blot、PCR、與報導基因（reporter gene）等，以下簡述幾種常見的方法： 1、電移位切試驗 / EMSA （Electrophoretic mobility shift assay） EMSA法是目前檢測 NF-κB與DNA結合活性 最經典的方法之一。 以同位素P或生物素biotin標記分子與NF-κB有共有序列的寡核苷酸探針，

【前言】 『報導基因法』(reporter gene) 是常見的分子生物手段。實作中會將報導基因與目標序列或調控序列連接(如圖1)，如將報導基因置於特定啟動子(promoter)後，用以研究其調控機制或表達/標定特定蛋白質。 報導基因的種類很多，簡單可根據分析檢測方法區分為。   體外型 體內型   體外型 ： 此類報導基因為" 分泌性 "報導 基因，如氯黴素乙醯基轉移酶基因（CAT）、人生長激素基因（hGH）及分泌型鹼性磷酸酶基因（SEAP）等，需在 含有報導分子的細胞裂解液或者細胞/組織培養液中進行。 體內型 ：可以在活的細胞或組織中進行，如綠色螢光蛋白基因（GFP）；而β-半乳糖苷酶基因（β-Gal）和螢火蟲冷光素酶( Firefly luciferase) 基因既可以在體外分析也可以在體內分析。 出處： https://www.researchgate.net/figure/Principle-of-the-reporter-gene-assay-A-plasmid-containing-a-reporter-gene-downstream-of_fig3_276917993 【常見報導基因的比較】 報導基因 優點 缺點 CAT 在哺乳動物中沒有內源性活性； 可用於自動化的 ELISA方法 檢測 線性範圍窄； 靈敏度相對較低； 需要使用 放射性同位素 β-Gal 蛋白穩定； 生物或化學發光檢測 靈敏 ； 不需要使用同位素 在哺乳動物細胞中有 內源性 活性 hGH 屬於分泌型報告蛋白； 操作簡便 靈敏度相對較低； 線性範圍較窄 SEAP 化學發光檢測法非常靈敏； 線性範圍較寬 ； 價格便宜 在某些細胞中具有 內源性 表達； 與篩選的化合物相互干擾 Luciferase 靈敏性好 ； 線性範圍寬； 沒有內源性表達； 測定簡便 蛋白的 半衰期較短 ； 常規分析重複性差 GFP 自發螢光； 應用廣 ， 有多種突變體可應用 敏感性較低 （沒有信號的放大） 【生物學活性檢測】   　　 藥物上市前都必需完整評估 藥物有效性 ，以瞭解有效活性成分及其使用濃度。在動物試驗、臨床前及臨床研究中，常以 生物學活性檢測 評估藥物的有效性和臨床應用價值 。 　　 普遍的生物學活性檢測方法主要 以 培養 細胞為基礎 的體外研究 。但近年生物藥的蓬勃