【智慧化製造2.0】如何準確篩選克隆，加速細胞株開發進程
【引言】 生物治療藥物 和 治療性蛋白質 的市場額在2018年達931.4億美元，預估到 2022 1 年底將成長近一倍。其中單株抗體藥的成長更是逐年上昇，過去5年內高達20%的FDA許可新藥是單株抗體藥，特別在癌症及自體免疫適應症上。而以如CHO細胞表達系統的技術沿革持續演進，已經逐漸突破早期生物藥生產過程中的一些瓶頸 2 …本文將以 低傷害性的單細胞分離技術 為例，與您分享新的系統及工作流程。 【材料與方法】 重組 DNA plasmid的構建 為了重組 tr-hIL15 蛋白與增強的綠色螢光蛋白(EGFP)共同表達，將相應的 tr-hIL15 CMV promoter下游和IRES上游的哺乳動物表達載體中， 隨後插入EGFP開放閱讀框和SV40 polyA (圖 1)。為了降低 IRES 序列的翻譯起始效率，刪除了 ATG11 和 ATG12 3-4 。重組質粒包含用於選擇穩定CHO細胞株的zeocin抗性基因，所有基因合成，隨後的克隆和定序均由 GenScript進行。 圖 1 基因表達盒示意圖。編碼治療蛋白和 EGFP 報告基因的 DNA 通過內部核糖體進入位點 (IRES) 連接，因此它們在同一 mRNA 中轉錄，獨立地翻譯成兩種蛋白質。 細胞培養和轉染 使用 125 mL 搖瓶在 37℃，5％ CO2、70-80％ 濕度和 125rpm 搖動下，培養FreeStyle CHO-S細胞懸浮生長。 生長培養基為 XP CHO Growth A 培養基。 將tr-IL15-IRES-EGFP plasmid電轉入細胞。添加3 % ClonaCellTM-CHO ACF supplement，協助轉染細胞恢復。 48-72h 後，轉染的細胞在 XP CHO Growth A 培養基中以 3-5x105 cells/ mL 的活細胞密度重新接種，該培養基中添加了 4 mM L- glutamine和 100 ug/mL ZeocinTM 試劑。 螢光輔助分選和克隆篩選 分選前 24 – 48 小時，將細胞以 5x10 5 cells /mL 的濃度接種在新鮮 XP CHO Growth A 選擇培養基中，並加入 300 ug/mL Zeocin 。 在分選當天，使用 CloneSelect Single Cell Printer( F.Sigh