Molecular Devices

【摘要】   報告基因系統已是非常成熟的真核生物細胞表達，及細胞生理的研究工具。一般常用的單一Luciferase系統容易受到操作流程中的pipetting操作差異、細胞裂解效率、細胞活性等影響實驗的有效性。採用了Firefly及Renilla兩種luciferase的雙報告基因系統，則能克服上述干擾，提供研究者更簡單可靠的結果。 近期的文獻中有多篇採用Molecular Devices microplate reader設備進行基於Luciferase報告基因的檢測案例，包括 Molecular Cell (Mol Cell. 2017 Jun 7. pii: S1097-2765(17)30362-3. 使用SpectraMax i3X) Nature(Nature. 2017 Jun 21. 使用SpectraMax系列) Nature medicine(Nat Med. 2017 Jun;23(6):742-752. 使用SpectraMax L)。 以Chen et al.發表在Molecular Cell的文獻為例，本文會帶領您從原理出發，如何設定SpectraMax i3x+自動注射器來快速完成DLR檢測。 【原理及注意事項】 螢火蟲Luciferase的公式非常重要，因為多數LUC檢測方法都是基於這個公式。例如通過改變基質的結構，引入特定的蛋白酶靶向序列就可以利用該公式進行酶的活性檢測，如以Caspase-3活性衡量細胞凋亡。 注意!! 要保證實驗環境無微生物污染，以避免其內生ATP干擾實驗結果。 圖2下為海腎Luciferase反應式，海腎Luciferase反應不依賴於ATP和鎂離子，故作為對照組，兩者結合就完成了是雙報告基因系統(DLR，案例見圖3右)。其原理可以通過海腎Luciferase的反應式闡釋(圖2下)。 在這裡也需要強調不同的酶反應之間的在這裡也需要強調不同的酶反應之間的 引入的試劑也絕對不能交叉污染 的，因為海腎Luciferase檢測時引入的抑制劑能非常強烈的抑制螢火蟲Luciferase反應。 注意!! 使用 自動注射器 進行檢測時，最好用“雙通道”機型避免交叉污染。 市面上主要有市面上主要有 快反應 和和 慢反應 兩種，選擇時需注意儀器配置，靈敏度和通量的需求。快反應型靈

以 20X 倍率一次性擷取全孔完整 spheroid 影像 以 96 或 384 孔格式篩選 3D spheroid 以共軛焦方法精準測量細胞反應 只保留 2D 重建影像以節省資料量   【背景介紹】   許多腫瘤細胞在合適的 3D matrix 下，可以培養成細胞球 (Spheroid) 形態。許多研究也顯示，使用細胞球培養代替一般的平面培養，因為與腫瘤實體類似， 3D 細胞球也包含曝露在球面的細胞和深埋在球內的細胞、都含有增殖和非增殖的細胞，並且細胞球中心是一個缺氧環境。更能模擬實際的腫瘤生理，得到更接近 In Vivo 的實驗數據。 近年來這些技術得到進一步的突破，可以大量、均一地在低吸附的微孔盤培養，越來越多的實例已成功地將這種 3D 細胞球模式運用於藥物篩選工作上，以開發潛在的癌症療法。   以下是您可能在建構一個 3D 細胞球分析可能遭遇的挑戰：   •      在每個孔中找到細胞球位置，精準置中並對焦，使每視野 (FOV) 拍到單一完整的細胞球，以利後續批量分析。 •      最佳化藥物及染色處理，兼顧染料滲透效果，並避免影響細胞球的位置。 •      只擷取 3D 結構中最有用的影像，減少非焦點的物體及背景。 •      快速將影像量化為分析數據，得出結論往下推進。 【材料 & 方法】   •      腫瘤細胞株： HCT116,DU145 和 HepG2 •      處理藥物： etoposide, paclitaxel 和 Mitomycin C •      螢光染劑 染劑名稱 目的 最終濃度 Hoechst Nuclear marker 16.2 µM (10 µg/mL) CellEvent Caspase 3/7 Apoptosis marker 7.5 µM MitoTracker Orange CMTMRos Mitochondrial potential marker 200 nM

【摘要】 DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，是常見的DNA染色劑，常用於螢光顯微、染色體擴散，FACS等應用[1-4]。但DAPI的發散波長較寬，易與FITC/GFP通道的檢測產生cross-talk，影響分析結果[5, 6]。另外DAPI染色通常需要固定細胞以達更好的效果。不大合適用於需要長時間觀察的活細胞樣品。本次專輯收集了兩種替代方案供讀者參考。 由Molecular Devices出品的 EarlyTox™ 試劑盒 。其中 Live Red染劑 可穿透膜對活細胞的細胞核DNA進行標記，且不影響細胞的活力狀態。另外，Live Red由622 nm激發，645 nm發射亦不影響GFP/FITC通道觀察。 透射光無染色標記(Stain free) 由Molecular Devices出品的SpectraMax Ⓡ MiniMax™300細胞成像系統，搭載專利 無標記技術 ，可於軟體中直接智慧辨識透射光影像，對所有細胞進行圈選並計數，可用於單一細胞形態或細胞群體的量分析。 【材料&方法】 CHO-K1細胞通過兩倍稀釋，以20,000到300個細胞每孔的密度種于96孔盤中，37°C培養過夜後，部分細胞用4%多聚甲醛（溶於PBS中）37°C固定30分鐘。 固定結束後用PBS清洗兩遍後用0.1% Triton X-100處理5分鐘。進一步用PBS清洗兩遍後用2.9 µM DAPI （溶於PBS中）染色30分鐘。染色結束後PBS清洗三遍。 剩下的細胞仍然保持活性，並通過活細胞染料進行染色。染料貯存液1:2000用PBS稀釋，然後加到細胞裡，孵育30min。 上機MiniMax 300進行影像擷取，記錄透射光（TL）及紅色（CY5）通道。 影像透過SoftMax Pro軟體進行辨識及分析。作為對照，相同的影像也匯入ImageXpress Ⓡ Micro XLS高內涵系統進行分析。 【分析結果】 如圖2所示，對於紅色通道，以SoftMax Pro預設的‘Nuclei’範本進行細胞核的辨識。對於透射光通道，以Stain Free範本辨識。 隨後以分析參數‘CellA’計算細胞數量。結果顯示，無標記細胞計數可以得到和螢光核染計數沒有差異（圖表2），表示透過MiniMax成像系統和SoftMax Pro軟體