【應用專輯】運用共軛焦高內涵技術， 快速篩選癌細胞球的藥理作用
- 以20X倍率一次性擷取全孔完整spheroid影像
- 以96或384孔格式篩選3D
spheroid
- 以共軛焦方法精準測量細胞反應
- 只保留2D重建影像以節省資料量
許多腫瘤細胞在合適的3D
matrix下，可以培養成細胞球(Spheroid)形態。許多研究也顯示，使用細胞球培養代替一般的平面培養，因為與腫瘤實體類似，3D 細胞球也包含曝露在球面的細胞和深埋在球內的細胞、都含有增殖和非增殖的細胞，並且細胞球中心是一個缺氧環境。更能模擬實際的腫瘤生理，得到更接近In Vivo的實驗數據。
近年來這些技術得到進一步的突破，可以大量、均一地在低吸附的微孔盤培養，越來越多的實例已成功地將這種3D細胞球模式運用於藥物篩選工作上，以開發潛在的癌症療法。
以下是您可能在建構一個3D細胞球分析可能遭遇的挑戰：
• 在每個孔中找到細胞球位置，精準置中並對焦，使每視野(FOV)拍到單一完整的細胞球，以利後續批量分析。
• 最佳化藥物及染色處理，兼顧染料滲透效果，並避免影響細胞球的位置。
• 只擷取 3D 結構中最有用的影像，減少非焦點的物體及背景。
• 快速將影像量化為分析數據，得出結論往下推進。
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腫瘤細胞株： HCT116,DU145 和 HepG2
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處理藥物：etoposide,
paclitaxel和 Mitomycin C
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螢光染劑
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染劑名稱 |
目的 |
最終濃度 |
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Hoechst |
Nuclear marker |
16.2 µM (10 µg/mL) |
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CellEvent Caspase 3/7 |
Apoptosis marker |
7.5 µM |
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MitoTracker Orange CMTMRos |
Mitochondrial potential marker |
200 nM |
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細胞養在培養瓶中(37℃ 和 5% CO2)。
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並使用含有適當濃度胎牛血清的細胞培養基重新懸浮細胞。
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然後以每孔 1000-1500 個細胞的濃度將細胞懸液鋪設在 96 孔或 384 孔 U 型底的黑色透明底盤中( Corning 4520 或 3830)。
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培養 24 小時後，每孔底部細胞開始形成單一的細胞球。
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連續培養細胞 2-4 天，直至細胞球尺寸符合實驗要求（圖1A）。
• 細胞球可以培養更長的時間，但細胞球過大可能妨礙下一步的染色滲透，導致最中心細胞無法成像。
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藥物處理：每孔細胞球處理10X濃度的藥物，培養 1-4 天。對於超過 2 天的藥物處理，藥物以 1 倍濃度每 2 天更換一次。這取決於所研究的藥物作用機理。較短的藥物作用時間用於研究細胞凋亡，較長的藥物作用時間用於多參數細胞毒性研究。
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螢光染色：完成藥物處理過程後，將所有染料混合在一起，以 4-6 倍濃度的條件直接加入到每孔中進行染色。染料無需洗滌過程，以避免對細胞球的位置和完整度的影響。
• 樣品上機： ImageXpress Confocal系統，以 10X或 20X物鏡拍Z-stack，再用Z-projection功能產生全景深的單張影像。( 圖 2 )。
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Tips：為什麼要用IXM Confocal系統? |
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生成更清晰的影像，以實現更精確的 Z 軸分割 共軛焦系統可以排除非焦平面的光暈，製造更薄的光學切片，重現更好的次細胞等級或細胞間細節，供後續分析更精確的影像分割(segmentation)。  |
淍亡濃度篩選
粒線體膜電位篩選
如果藥物作用途徑是透過影響粒線體代謝來抑制腫瘤生長，則可染色MitoTracker可對粒線體進行膜電位評估，根據細胞球內的橙色的強度，檢測粒線體的健康狀況。
本文提及的In Vivo 3D細胞球的培養系統能夠產生”大小均一”的人類癌細胞球，特別適合與全自動化、高通量的高內涵影像結合，用以解決篩選化療候選藥的龐大分析工作。
IXM Confocal和
MetaXpress解決方案，讓您同時擁有寬場成像的速度和共軛焦等級的清晰結果，一台機器滿足不同實驗的需求。
主要特點
• 在
20 X物鏡下只需要一個視野即可獲得完整的細胞球
• 支援 96 /384 微孔盤格式
• 轉盤式共軛焦(Spinning disc)可快速完成高解析拍照
• 可選擇只保存最佳投影的2D圖來節省存儲空間。
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