【領讀專欄】《Nature Communications》：利用人類基因組RNAi screen找腸病毒71型(EV71)複製宿主因子(host factor)

5月 20, 2021

`[註]Host factor:醫學用術語，指的是易感疾病之個體物的生物特徵`

Human genome-wide RNAi-screen reveals host factors required for enterovirus 71 replication.

Nature Communications volume7,Articlenumber: 13150 (2016)

https://www.nature.com/articles/ncomms13150

【Abstract】

腸病毒感染為幼兒常見的疾病，腸病毒指的是一群病毒，包含小兒麻痺病毒、克沙奇病毒、伊科病毒及腸病毒等種類，每一個種類還可分為多種型別，總共有數十種以上。腸病毒71型（EV71）是一種嗜神經型腸病毒，其宿主與病原體之間的相互作用尚不清楚。本文利用指的是一群病毒，包含小兒麻痺病毒、克沙奇病毒、伊科病毒及腸病毒等種類，每一個種類還可分為多種型別，總共有數十種以上。腸病毒71型（EV71）是一種嗜神經型腸病毒，其宿主與病原體之間的相互作用尚不清楚。本文利用全基因組的RNAi篩選(Genome-wide RNAi screen)技術，鑑別出256個參與EV71在人類橫紋肌肉瘤細胞中複製的宿主因子。再通過enrichment analysis方法，確定其在細胞週期調節和內質網相關降解作用中的角色。

【about EV71】

EV71對於中樞神經系統有極高的感染性，臨床上出現症狀包括腦炎（encephalitis）、無菌性腦膜炎（asepticmeningitis）、急性無力肢體麻痹（acuteflaccidparalysis）、手足口症（hand-foot-mouthdisease）、皰疹性咽喉炎（herpangina）、急性出血性結膜炎（acutehemorrhagicconjuctivitis）、肌肉僵直（myoclonicjerk）、頭痛（headache）、發燒（fever）及嘔吐（vomiting）等。而其中以手足口症及泡疹性咽喉炎最為常見，所以EV71引起的疾病常被稱作手足口病。

另一種人類腸道病毒中，與EV71在系統上最接近的克沙奇病毒（CA16），也能引起類似症狀。

【Keynote】

1. 本文篩選了橫紋肌肉瘤細胞(RD)中21,121個人類基因的全基因組siRNA庫的免疫螢光表型，篩選出參與EV71複製的256個宿主因子。

2. 其中有兩種激酶CDK6和AURKB是EV71的抗性因子（HRFs），另外有兩種內質網降解（ERAD）途徑相關的蛋白酶NGLY1和VCP是EV71的敏感因子（HSFs）。

3. 特定的細胞週期也會對病毒的感染及複製效率具有促進作用。

4. 與囊泡運輸相關的蛋白RDX也是EV71病毒重要的宿主因子，在基因敲除實驗中表明其可能起著促進EV71病毒進入和/或複製的作用。

【Method】

本次導讀將著眼於研究者如何大量使用高內涵技術，以免疫螢光染色為基礎，篩選RNAi、並對篩選出的靶點，進行功能驗證(functional validation)的環節。

1. RNAi庫篩選、藥物靶點篩選

蛋白質定量和病毒感染陽性分析都可以使用MetaXpress軟體中的Multi-wavelength Cell Scoring模組進行量化，透過DAPI染色可得出全體細胞的數量及位置，再透過positive marker定義陽性反應的細胞，勾選完計算參數後，系統可以快速給出整群細胞的分析值，如陽性率，或單一細胞的分析值，如細胞內目標蛋白的螢光強度、面積、形態、分佈等等(圖1)。

在後期發現藥物靶點(NGLY1抑制劑Z-VAD-fmk)後，也是透過相同的手段來評估潛在藥物的有效性。

完成基因敲除及EV71感染後，將感染細胞固定，並對EV71結構蛋白VP0/VP2以及細胞核進行免疫螢光染色，透過ImageXpress進行影像自動擷取及分析，計算陽性的細胞數量和細胞總數的結果(圖3)。

在第一階段的功能驗證中，發現CDK6活性可以限制EV71的複製。為進一步瞭解其機制，一樣可使用免疫螢光法，追蹤內源性CDK6在EV71感染後的細胞定位，在這裡發現EV71感染後期，細胞核內CDK6轉移至細胞質(圖4c)。

2. 細胞週期分析

透過DAPI及PI染色的比例，可以用影像方式區分細胞處在細胞分裂的何種階段。Cell Cycle影像分析模組，可以立即對盤中的所有細胞作分類及計算。

此研究使用細胞週期分析來評估細胞對病毒感染的敏感性。實驗通過在不同細胞週期進行血清剝奪實驗，以及用特定藥物抑制某一特定細胞分裂時期，評估哪個時期對病毒複製最為關鍵，然後利用小分子抑制劑進行某一分裂時期的抑制做為對照進行重複驗證。

這些結果表明EV71的複製在非增殖細胞中受到限制，但在分裂細胞的特定細胞週期階段（CDK6的G1/S和AURKB的G2/M，圖6f）得到增強。

在觀察EV71感染的RD細胞中，發現NGLY1在富含雙鏈RNA(dsRNA)的囊泡中有明顯的積累，這表明NGLY1在病毒誘導的複製囊泡中發揮了功能（圖7e）。

VCP在蛋白酶體降解的ER蛋白的逆轉錄轉運中起作用，也被鑒定與NGLY1相互作用。研究者發現VCP的ATP酶活性對EV71的複製至關重要。使用其可逆抑制劑DBeQ抑制VCP可顯著減少EV71感染細胞（圖8c）。

【Conclusion】

ImageXpress Micro System

使用使用高內涵為工具的全基因組RNAi篩選方法，在此篇研究中已證實可快速收集或驗證廣泛而多樣的宿主因子和途徑，並加速此類對人類健康有重大威脅的藥物或治療方法的開發，可以為其他欲加快研究腳步的科學家的借鏡。

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