【應用專題】淺析細胞內NF-κB信息傳遞路徑及常見檢測方法
『細胞信息傳遞路徑』的概念從80年代被提出，解釋細胞外的分子訊號經細胞膜傳入胞內後，一系列促酶（磷酸化、泛素化等）的反應路徑，改變路徑中蛋白的結構的過程。
一般情況下，膽固醇等脂質可直接穿透脂雙層細胞膜進入細胞，但訊號分子是多肽類（如生長因子、細胞因子、激素、神經傳遞物質以及其它小分子化合物等），只能先與胞膜上的受體蛋白（通常為穿膜蛋白transmembrane protein）或稱為配體（adaptor）結合後，再啟動下游一系列反應。
諾貝爾獎獲得者David Baltimore（圖1）于1986年發現的NF-κB，是從B淋巴細胞的細胞核萃取物中找到的轉錄因子。NF是細胞核因子，κB命名是因為它能與免疫球蛋白kappa輕鏈基因的擴增子B序列特異性結合，促進κ輕鏈基因表達。其本身是一種蛋白質複合物，能夠調控轉錄的DNA、細胞因子的產生以及細胞存活[1]。
NF-κB在細胞訊息傳遞領域中具有舉足輕重的地位，已知NF-κB參與細胞對刺激的反應，如自由基、重金屬、紫外線照射、氧化LDL和細菌或病毒抗原等。如果出現調節異常，會引起發炎反應、自體免疫疾病、感染性休克、細胞增生/分化/凋亡的紊亂。
目前大家熟知NF-κB在天然免疫機制中發揮著非常重要作用，也有很多文章研究發現NF-κB是發炎和癌症之間的重要關鍵。最近的一篇文章研究發現，酒精和其他濫用藥物可誘導大腦中的NF-κB活性和細胞因子表達，認為NF-κB和『酒精及藥物成癮』可能存在聯繫[2]。
由於NF-κB是轉錄因子，它的活性主要作用在兩方面：DNA結合活性和反式啟動活性
1. 檢測其結合活性最經典的方法是EMSA 2. 反式啟動能力檢測方式則以NF-kB的報導基因測定較為理想。
其他已開發的『NF-κB訊號通路檢測方法』還有，Western Blot、PCR、與報導基因（reporter gene）等，以下簡述幾種常見的方法：
1、電移位切試驗 / EMSA （Electrophoretic mobility shift assay）
EMSA法是目前檢測NF-κB與DNA結合活性最經典的方法之一。
以同位素P或生物素biotin標記分子與NF-κB有共有序列的寡核苷酸探針，結合到NF-κB後，於非變性條件下電泳，因為其分子量和表面電荷發生改變，其電泳速率比未結合的游離探針慢。顯影後分析膠體條帶亮度以計算其活性。放射性標記物雖然靈敏度高，但是有污染疑慮，許多研究者會選擇非放射性方法以冷光檢測。
2、酵素連結免疫吸附法/ELISA
（ELISA，Enzyme-linked immunosorbent assay）
以ELISA法定量轉錄因子，其特點是便宜、簡便、快速。
實驗前需先將含有NF-κB結合位點的特定雙鏈DNA序列（5’-GGGACTTTCC-3’）鍍於微孔盤底。加入核萃取物後，活性NF-κB分子會專一性地與盤底的寡核苷酸探針結合。清洗後加入一抗識別p50、p52、p65、c-Rel或RelB，最後用HRP標記的特異性二抗與一抗結合完成ELISA。呈色後使用如SpectraMax ABS plus讀取OD450，分析樣品中的活性量（圖4）。
3、西方式墨點法/Western Blot
WB的方法具有成本低、耗時少、操作簡單等優勢，是最常用的方法。通常情況下，WB常用於檢測兩種條件
1.『NF-κB蛋白表達量』。
2.『細胞質的IκB的降解量』，
但是因為並不是NF-κB複合蛋白核轉運了後就一定能參與基因調控，所以Western Blot僅僅可以獲得核轉運的NF-κB蛋白含量，不能直接反應出NF-κB的活性。
4、報導基因/Reporter Gene
報導基因是常見的基因表達的研究工具，廣泛運用在各類訊號傳遞路徑或疾病研究中。此處針對如何對『雙螢光訊號系統』（圖6）最佳化，從NF-kB的反式啟動能力，來間接分析NF-kB的活性。
1. 將10μg/mL TNF-α的溶液加入細胞培養液稀釋到20ng/ml製成誘導溶液（induction solution），並使用純細胞培養液培養基作為對照。
2. 在37℃培養7小時後，用PBS清洗細胞一次，再加入20μL細胞溶解液並於室溫作用15分鐘後進行偵測。
於不同轉染試劑對DNA比例中的測試發現，各條件均能檢測到高度的海腎（Renilla）螢光素酶表現，是否加入TNF-α並無太大影響；相比之下，加入TNF-α會大大增加螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）的表現。整體而言，轉染試劑與DNA比例為2：1時螢光素酶的表現最低（圖7）。
將螢火蟲螢光素酶訊號對海腎螢光素酶訊號進行常態化（normalization）校正後，可明顯看到有TNF-α誘導的組別在3個轉染比例下均有明顯差異（圖8）。
加權計算兩種效應後（表１），結論2.5：1轉染試劑與DNA比例可獲得最佳誘導效果。
參考文獻
[1] Sen R, Baltimore D. Inducibility of kappa immunoglobulin enhancer-binding protein Nf-kappa B by a posttranslational mechanism. Cell.1986, 26;47（6）：921-8
[2] S.E. Nennig and J.R. Schank. The Role of NFkB in Drug Addiction： Beyond Inflammation, Alcohol and Alcoholism, 2017, 52（2） 172–179
[3] Hayden MS, Ghosh S （2008） Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell 132（3）, 344–62
[4]Chen J, Chen ZJ （2013） Regulation of NF-κB by ubiquitination. Curr. Opin. Immunol. 25（1）, 4–12
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