【摘要】

　細胞是生物體基本的結構和功能單位，也是生命活動的基本單位。細胞模型已經成為藥物篩選和疾病研究最常用、也最基礎的生物平台。以細胞健康測定為例，以螢光標定後，可結合如微孔盤測讀，顯微影像或流氏系統進行定量分析。

【螢光法】

　螢光法是一種染色標定的策略，利用分子團可吸收特定波長的激發光(Excitation)，短暫維持後逸散出發射光(Emission)的特性(圖1&圖2)。配合光學儀器的濾片篩選(圖3)，將受標定的目標顯示出來。因為未被標定的背景及物體無法發光，可以大幅提昇觀測的靈敏度及動態範圍，特別適合用來觀測細胞，甚至次細胞層級的細微構造及變化。

細胞活力

　從不同的切入點量測細胞健康/活力狀態，可以提供研究者更有效的資訊去評估諸如候選藥物反應，作用途徑的活化/抑制因子，報導基因等。這裡使用Calcium AM染劑為例，它是一種活細胞用的螢光細胞染劑，有絕佳的細胞膜穿透力。染劑進入細胞後，會被酯酶水解為Calcein，發出強綠色螢光。Calcein AM的另一優勢是的細胞毒性極低，非常適合於長時間活細胞實驗。

應用上也會搭配Ethidium homodimer（如EthD-III）等同時檢測細胞死亡事件。EthD-III本身幾無螢光，也不能通透細胞膜，但一旦細胞膜完整性破壞，EthD-III就可滲入並和核酸相結合，發出明亮的紅色螢光。Calcein AM與EthD-III同時使用，可以更靈敏的反應細胞群體的活力狀態，不受起始細胞密度誤差的影響，適用于高通量藥物毒性和細胞增殖分析。

【範例】以SpectraMax® iD3檢測細胞活力狀態

以SpectraMax iD3進行觀測及記錄，並以SoftMax Pro內建的EarlyTox範本進行後續分析。

【實驗材料及方法】

這裡推薦採用Molecular Devices提供的免洗式EarlyTox系列試劑盒，包括

· EarlyTox Live Cell Assay kit
(P/N R8342標準包或P/N R8343重量包)
· EarlyTox Glutathione Assay Kit
(P/N R8344標準包或P/N R8345重量包)
· EarlyTox Caspase-3/7 R110 Assay Kit
(P/N R8346標準包或P/N R8347重量包)

【主要步驟】(圖4)：

HeLa細胞調整為20,000 cell/100uL的濃度，平舖於黑色透明底微孔盤(96 或 384 孔)。
以37°C/5% CO₂條件過夜培養。細胞凋亡以10~40nM的staurosporine誘導，處理24小時。
加入2x working solution，室溫或 37°C下培養1小時。
按照推薦的參數進行檢測和分析。此步可以對比頂部讀取和底部讀取獲得最佳的設定，同時推薦孔掃描模式(well scan)提升資料的品質和一致性。

【範例】以 ImageXpress® Pico檢測細胞活力

【實驗材料】

EarlyTox Live/Dead Assay Kit；
HeLa細胞 (ATCC P/N CCL-2)；
Stauroporine (Sigma P/N S5921)；
Mitomycin C (Sigma P/N M4287)；
384-孔黑色,透明底微孔盤 (Corning Falcon P/N 62406-490)；
ImageXpress Pico自動細胞影像系統和 CellReporterXpress軟體

【實驗方法】

HeLa細胞以5,000顆/孔密度，接種於384孔黑色透明底微孔盤中，過夜培養。
十字孢堿(staurosporine)和絲裂黴素C(Mitomycin C)處理細胞24小時，做4個平行，按1:3梯度稀釋，起始最高濃度為10μM星孢菌素和300μM絲裂黴素C
Live/Dead檢測試劑結合Hoechst 33342細胞核染劑，對細胞進行染色
在 ImageXpress Pico系統上用10x Plan Fluor 物鏡進行成像：Calcein AM-FITC通道；EthD-III-Texas Red通道；Hoechst-DAPI通道

細胞凋亡

　細胞凋亡是指為維持體內環境穩定，由基因控制的細胞自主、有序的死亡。與細胞壞死最大的不同是，它是主動而非被動的過程，涉及一系列基因的啟動、表達以及調控等的作用。

　Caspase (cysteinyl aspartate speciﬁc proteinase，天冬氨酸蛋白水解酶）是一群細胞質中具有類似結構的蛋白酶，也是直接導致凋亡的蛋白酶系統，在誘導凋亡的過程中擔任重要角色。特別是細胞凋亡執行者caspase-3/6/7。

EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 檢測試劑盒

　NucView 488 Caspase-3基質可用於檢測完整細胞中的Caspase-3/7活性，且不干擾Caspase活性。它是由一種可與Caspase-3/7 DEVD識別序列結合的螢光核酸染料組成。在細胞外不會發出螢光，但進入細胞質後，Caspase-3/7酶會將基質裂解，釋放出的核酸染料將染上細胞核，染劑會在在500nm激發光照射下發出明亮的綠螢光。

【範例】以SpectraMax i3x檢測細胞淍亡

　使用 SpectraMax i3x 評估GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子) 和TNF-α(腫瘤壞死因子)誘導的細胞凋亡。

【實驗材料】

U937 細胞（ATCC Cat.# CRL-1593.2）
人類 TNFα （Peprotech Cat# 300-01）
人類 GM-CSF（Peprotech Cat# 300-03）
EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488檢測試劑盒（Cat.#R8348）
96孔黑色透明底，TC-處理的微孔盤（Corning cat. #3904）

【實驗方法】

U937細胞培養在RPMI1640培養基中，添加10%FBS和青黴素/鏈黴素。
實驗當天，細胞以每孔100,000細胞/80µL濃度接種。
每孔加入20µL的5X濃度細胞因子(最終濃度為1X，總體積為100µL)
在37°C、5% CO₂下孵育處理24或48小時。
將10µM2X的NucView488基質工作液混合於PBS中，100µL基質工作液加入含有100 µL細胞和培養基的孔中形成終濃度為5µM基質，細胞在室溫下避光培養1小時。
上機，使用SpectraMax i3x進行讀盤。

　結果顯示，單獨加入TNFα的組別，24小時/48小時不同處理時間上，皆有較明顯的劑量反應。相對單獨加入GM-CSF組別則沒有誘導細胞凋亡效果。但是當TNFα和GM-CSF混合則出現明顯的協同作用。有文獻指出GM-CSF相對於TNFα需要更長作用時間（>72小時）才能透過caspase-3途徑誘導U937細胞凋亡，本次試驗結果亦顯示，處理24小時的組別中，兩種細胞因子彼此有抵銷或干擾，但處理48小時後，兩者則明顯有協同作用，低濃度(5ng/mL)即能有效誘導細胞淍亡。

【範例】以 ImageXpress® Pico 系統分析細胞凋亡

【實驗材料】

HeLa細胞（ATCC P/N CCL-2）
HeLa培養基：

DMEM: CellGro, with L-glutmaine（Corning）；
10% FBS（BenchMark™;Gemini P/N 100-106）

1% penicillin/streptomycin
Staurosporine（Sigma P/N S5921）
Mitomycin C（Sigma P/N M4287）
Camptothecin（Sigma P/N C9911）
EarlyTox Caspase-3/7 NucView488 Assay Kit（Molecular Devices P/N R8348）
96孔黑色透明底微孔盤（Greiner P/N 655090）
ImageXpress® Pico系統，進行全自動顯微影像擷取
CellReporterXpress軟體，進行影像處理及量化分析

【實驗方法】

將HeLa細胞株培養在Greiner 96孔黑色透明底微孔盤中，種植5,000細胞/孔的濃度，以5% CO₂/37°C條件下培養過夜。
次日，處理不同濃度的藥物18小時，誘導細胞凋亡。
十字孢堿（Staurosporine）:最高10μM
絲裂黴素C (Mitomycin C）:最高200μM
喜樹堿(Camptothecin）:最高100μM
以EarlyTox Caspase-3/7試劑組進行細胞染色
加入5μM NucView 488和3μM Ethidium Homodimer III，
培養30分鐘最後加入6μM Hoechst 33342染核，培養15分鐘。
以ImageXpress®Pico系統進行影像擷取
將製備完成的樣品盤放入樣品艙
設定拍照條件為：10x物鏡，每孔一張，
濾片組選擇DAPI=20ms,FITC=500ms和 TexasRed=50ms)，
PS:曝光時間依實際樣品狀態調整。

以CellReporterXpress軟體進行量化分析，得到凋亡細胞數量和百分比(綠vs藍)及死細胞數量/百分比(紅vs藍)。根據實驗結果繪制細胞凋亡、細胞死亡的濃度效應曲線，並計算EC50值。

【結論】

　螢光細胞檢測是目前最廣泛使用的技術，常用設備包括的微孔盤測讀儀、流式細胞儀、螢光顯微鏡、共軛焦顯微鏡、高內涵影像系統(HCS)等。本文介紹以EarlyTox試劑組為例，示範幾種常見的監測、觀察細胞健康狀態的方法，透過系統本身簡潔的操作及分析設定，協助使用者快速有效地取得量化資料，加速實驗進程。

除本文介紹範例外，如細胞核標記染料5-乙炔基-2’-去氧尿嘧啶核苷(Edu)，也常用於測量細胞增殖，或測定細胞狀態的指標。另外，在如SpectraMax i系列的多功能微孔盤測讀儀上，除了螢光還可組合光吸收、冷光等方法學，供使用者針對不同需求及條件，進行細胞活力、毒性及凋亡的檢測，提供最大的應用彈性。

【好評推薦】