【應用專輯】應用FLIPR及iCell心肌細胞，在早期檢測候選藥物的心毒性
在藥物開發早期，會使用in vitro模型評估對心臟功能和安全性，由誘導多能幹細胞（iPSC）分化的心肌細胞，可以觀察Ca+振盪的結果分析心肌細胞的搏動狀況，因此使用高速型儀器，配合鈣敏感染料如EarlyTox™ kit，以及進行ScreenWorks Pro專業軟體可以高通量檢測藥物對心肌細胞的跳動峰值、頻率，振幅等參數，確保候選藥物安全性，節省後續開發時間及成本。
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縮短細胞培養時間，提高實驗的工作流程和品質
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在藥物發現過程中更早地發現可能導致安全問題的化合物
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ScreenWorks Peak Pro軟體簡化資料分析
由Cellular Dynamics開發的iCell Cardiac系列增強了iPSCs分化的心肌細胞的蘇後恢復速度。可使細胞培義流程縮短5-7天。本文中將匯整一些癌症化合物的檢測，其中一些已知會影響hERG通道，其它化合物已知可以阻斷hERG通道。
【材料】
˙ Cell® Cardiomyocytes2試劑盒，包括細胞、鋪板培養基和維持培養基(Provided by Cellular Dynamics, International)
˙ 0.1%(w/v)明膠
˙ 38孔黑壁底透微孔盤 (Corning PN 3712)
˙ EarlyTox心肌細胞毒性檢測試劑盒 (Molecular Devices PN R8210)
˙ 測試化合物和DMSO (Sigma Aldrich)
˙ FLIPR
Penta高通量即時螢光檢測分析系統(Molecular
Devices)
【方法】
準備iCell心肌細胞微孔盤
在iCell心肌細胞使用指南的指導下，用0.1%的明膠包被384孔黑壁底透微孔盤。iCell心肌細胞復蘇後以8000個細胞每孔的密度鋪在每孔25μL的培養基中。細胞在37°C、5% CO2、以及100%濕度條件下培養24小時。形成單層細胞並更換成維持培養基。細胞每隔一天更換一次維持培養基。在第5天，細胞開始同步跳動並可以用於實驗。
準備化合物板用於篩選檢測
為便於篩選檢測，化合物溶於100%DMSO配置成10mm的母液。維持培養基稀釋原液至10-100μM的檢測濃度。在使用FLIPR Penta系統檢測前，提前24小時將稀釋好的化合物溶液添加到每個孔中。DMSO在培養基中的最終濃度為0.15%（v / v）。濃度範圍從30或100μM對數稀釋的每個濃度的化合物進行兩次 （n=2）或三次（n=3）的檢測。
使用FLIPR Penta系統觀察鈣振盪
實驗前24小時，以終濃度30μM開始的對數稀釋的各種化合物加入到iPSC心肌細胞中。檢測前2小時，取25μL EarlyTox溶於維持培養基，調整至2倍濃度後，添加到每孔中，並在37°C、5% CO2條件下培養。當細胞從培養箱取出後，鈣離子濃度的變化會隨著心肌細胞的搏動而變化，此時可用FLIPR Penta系統記錄的螢光訊號變化。
原始資料經過ScreenWork軟體的縫隙連接及時間點同步功能處理過後再行分析峰值頻率。
用於實驗研究的抗腫瘤化合物包括：舒尼替尼、伊馬替尼和星形孢菌素（由於毒性原因而不作臨床使用的化合物）均是激酶抑制劑；白消安，一個烷基磺酸鹽；阿黴素，一種蒽環類藥物；依託泊苷，一種拓撲異構酶II抑制劑；而紫杉醇會干擾細胞管蛋白的生成。在化合物添加24小時後，一些鈣振盪信號變化明顯異於對照組（圖2）。
舒尼替尼的振盪頻率較低，且在10%峰值高度的峰寬顯著大於對照組。其它具有相似鈣振盪結果的抗癌化合物包括伊馬替尼（Imatinib）和星形孢菌素（Staurosporine）。這三種化合物與阻斷hERG通道有關。 hERG基因編碼了鉀通道，有助於心臟跳動的恢復，其被阻斷有可能引起長QT綜合征或尖端扭轉型室性心律失常。紫杉醇、白消安和依託泊苷未知有hERG活性，且沒有類似的鈣振盪減慢效應，也沒有10%峰值高度的峰寬增大的效應。量效曲線顯示，24小時暴露于阿黴素和舒尼替尼後峰值頻率顯著降低。紫杉醇也是一種不影響峰值頻率的化合物（圖3）。
除抗癌化合物外，已知的hERG阻斷劑氟呱利多，一種抗精神病藥物和多巴胺受體阻斷劑；阿米替林，三環抗抑鬱藥和5-羥色胺受體抑制劑；以及西沙必利，一種抗酸劑，均是已知的可導致長QT綜合征。此三種化合物也都在實驗中進行了檢測。在24小時內加入iPSC2s時，這三種化合物的峰值頻率都在降低以及10%峰值高度的峰寬增大 (圖4)。在鈣振盪測定中所測試的所有化合物的IC50值的總結如（表2）所示。
˙ iPSC2可大幅節縮短細胞培養時間及成本。
˙ FLIPR Penta系統能同步檢測全盤的細胞反應，減少孔間誤差。
˙ ScreenWorks軟體可以高效並簡化資料分析，快速取得結果。
˙ 利用觀測心肌細胞的鈣離子方法，可以幫助在藥物開發早期，儘早排除對心臟產生不利或有益影響的候選化合物，提昇開發效率及成功率。
參考文獻
1. Sirenko, Oksana, et al. “Phenotypic Assays for Characterizing Compound Effects on Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids.” ASSAY and Drug Development Technologies, vol. 15, no. 6, 2017, pp. 280–296., doi:10.1089/adt.2017.792.
2. Sirenko, Oksana, et al. “In vitro cardiotoxicity assessment of environmental chemicals using an organotypic human induced pluripotent stem cell-Derived model.” Toxicology and Applied Pharmacology, vol. 322, 2017, pp. 60–74., doi:10.1016/j.taap.2017.02.020.
3. Sirenko, Oksana, et al. “Assessment of beating parameters in human induced pluripotent stem cells enables quantitative in vitro screening for cardiotoxicity.” Toxicology and Applied Pharmacology, vol. 273, no. 3, 2013, pp. 500–507., doi:10.1016/j.taap.2013.09.017.
4. “iCell Cardiomyocytes2 User Guide.” Cellular Dynamics International, Aug 2016.
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