【應用專輯】細胞凋亡實驗自動化影像分析

【摘要】

　　細胞凋亡是一種發生在多細胞生物體內的程式性細胞死亡過程(Program Cell Death)，特微是細胞形態逐步變化並造成細胞死亡。

　　形態變化包括形態變化包括細胞收縮、核分裂、染色質凝縮、染色體斷裂及 mRNA 衰減。細胞凋亡是一種高度調控的過程，通過內在途經對各種壓力源做出回應，包括饑餓、感染、缺氧和氧化應激反應等。

　　粒線體損傷在細胞凋亡的啟動過程中發揮重要的作用。在外部通路中，外部信號介導了細胞凋亡的產生，包括腫瘤壞死因子受體家族介導信號。在細胞凋亡的啟動過程中發揮重要的作用。在外部通路中，外部信號介導了細胞凋亡的產生，包括腫瘤壞死因子受體家族介導信號。細胞凋亡調控過程的破壞與包括癌症在內的許多疾病相關。本篇專輯將介紹一種利用自動細胞成像系統進行細胞凋亡檢測的方法。

自動化的優勢

• 採用簡單、免洗的均質化(homogenous)方法評估細胞凋亡狀態

• 系統快速獲取並分析圖像，並以規格化資料庫統一管理

• 採用自動分析模組取代人工，快速對待檢細胞進行量化分析，減少主觀偏差

【方法】

　　將人宮頸癌細胞系 HeLa，培養在 Greiner 公司黑邊底透的 96 孔多孔盤中，每孔 5,000 個細胞，37°C，5%CO2 條件下過夜培養。

• 第二天，分別用不同濃度的抗腫瘤化合物十字孢堿(Staurosporine)、絲裂黴素 C(Mitomycin C)和喜樹堿(Camptothecin)處理這些細胞誘導凋亡。化合物的最高濃度分別為：10μM 十字孢堿；200μM 絲裂黴素 C；100μM 喜樹堿。

• 加藥處理 18 小時後，使用試劑盒 EarlyTox™Caspase-3/7 NucView 488dye 和 Ethidium Homodimer III 染料以終濃度 5μM 和 3μM 分別對細胞染色 30 分鐘，之後用 Hoechst 33342 以終濃度 6μM 對細胞進行染色，同時將細胞放回 37°C，5%CO2 培養箱中靜置 15 分鐘。

【EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 試劑盒】

　　Caspase-3、Caspase-7 是在細胞程式性死亡過程中被啟動的蛋白酶。EarlyTox 試劑盒中的 Caspase-3/7 Nuc View 488 底物用來檢測完整細胞中 caspase-3/7 活性。底物由一種與 Caspase-3/7 DEVD 識別序列結合的螢光 DNA 染料組成。最初沒有螢光，底物透過細胞膜進入細胞質中。在凋亡細胞中 Caspase-3/7 將底物裂解，釋放出的高親和 DNA 染料與細胞核中的 DNA 結合，在 500nm 激發光照射下在 530nm 處發出明亮的綠色螢光，可以用來評估 Caspase 激酶的啟動水準。

　　Hoechst 33342 核染料用來確定 Hoechst 33342 核染料用來確定細胞總個數，

　　Ethidium Homodimer 用來確定 Ethidium Homodimer 用來確定死細胞 (即外膜受損的細胞) 的個數。

【系統成像及分析】

　　染色之後，使用 ImageXpress® Pico 自動細胞成像系統，在 10x 物鏡條件下對細胞進行成像。每個成像位置分別採集 DAPI，FITC 和 TexasRed 三個螢光通道，曝光時間分別為 20, 500 和 50ms。

　　圖1 展示了對照細胞及實驗組細胞結果，其中實驗組的化合物濃度分別為 0.3μM 十字孢堿、10μM 絲裂黴素 C。 Hoechst 染色為藍色，凋亡細胞核為綠色，死細胞核為紅色。

　　使用 Cell Reporter Xpress 軟體中的凋亡分析流程採集樣品圖像並進行分析，得到凋亡細胞數量和百分含量。同時，通過分析 Ethidium Homodimer 染色結果得到死細胞數量，通過分析 Hoechst 染色結果得到細胞總數的相關參數。

　　根據實驗結果生成細胞凋亡、死亡的濃度效應曲線及相應的半最大效應濃度(EC50)值見圖2。

　　值得注意的是激酶抑制劑十字孢堿 (一種已知的細胞凋亡誘導物)的 EC50 值比通過不同的機制介導細胞調亡的絲裂黴素 C 低 100 倍左右。

【產品介紹】

EarlyTox 試劑盒是一種有效的工具，可用於疾病生物學研究、抗腫瘤藥物評價及細胞健康狀況監測等領域。

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參考文獻

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