【應用專輯】人類與細菌的永恆爭鬥

 





【摘要】


在「槍炮、病菌與鋼鐵」一書中探討了人類一萬三千多年的歷史，人類族群的生存競爭從未停歇，其中病菌也扮演了重要的角色，它們殺死的人，遠遠多過來自歐洲征服者的槍炮。例如結核就是疾病總量最高的細菌性疾病之一，是由結核桿菌所傳染，肺炎就是由鏈球菌屬及假單胞菌造成，病原細菌也是開發中國家高嬰兒死亡率的原因之一。[1]

【超級細菌與超級抗生素戰爭】

抗生素推動了二十世紀的巨大醫學進步，大幅增加了病患的生存率及壽命。直到超級細菌的誕生，人類可能因為抗生素的濫用，讓醫學倒退到無藥可救的時代。WHO在2019更新了「抗微生物管理計畫」指導手冊(Antimicrobial stewardship programme - a who practical toolkit)[2] ，希望藉由適當管理機制，減少抗生素濫用，減緩抗藥性產生的速度，希望為我們，多爭取一點時間。

另一方面，在新式抗生素的開拓之路上，如何更有效篩選和鑒定是許多研究所關心的。此處借鑒荷蘭牙科學術中心(ACTA)預防牙科的研究報告[3]，讓我們一起學習，如何使用SpectraMax i3x +SoftMax Pro，將觀測及分析流程自動化，更快更有效推進研究進度。




【材料】



• 含有質粒 pMV 158 - GFP 的糞腸球菌菌株OG1RF

• 黑色 96 孔底透微孔板（Greiner Bio-One 公司，＃655096）

• qPCR 密封膜（Eurogentec 公司，＃RT-OPSL）

• SpectraMax i3x 多功能光譜分析儀，包括 SoftMax Pro 7.x軟體（Molecular Devices公司）

 


【Mission 1】運用流程編輯器(Workflow Editor)進行長時間吸光值和螢光多線記錄



取5組不同條件的GFP標記的糞腸球菌樣品與PBS(對照組)各150uL，依序加入96孔透明底的黑色微孔盤中，並封盤防止長時間觀察的蒸散。



開啟SoftMax Pro的流程編輯器(workflow editor)，可以拖曳指定的icon組合所需的多維實驗流程。本實驗需要每15分鐘，先震盪5秒將菌液重新懸浮，後各讀取OD600和GFP螢光強度(485/515)[圖1]，連續觀察18小時。OD600和GFP螢光會依時間獨立記錄各自分頁中。


【Tips】
如果間隔時間更長的實驗(如>8hr)，為了不佔據儀器，或移回培養箱給予更好的培養條件，建議使用SoftMax Pro另一個功能：「非連續讀取」，利用接續功能(append...)[圖2]，可以相同條件接續一組已儲存的kinetic類型實驗。(本次實驗沒有使用該功能)


【Mission 2】運用Data Reduction快捷分析功能整理



完成18小時的實驗後，原始資料(raw data)隨即以線圖的方式呈現在主畫面，此時可以雙點開啟單一格，或選取多格雙擊放大檢視原始資料。接下來，我們要運用「Data reduction」快捷功能[圖3]，直接將整理數據成為更有意義的資訊。






開啟「Data reduction」對話框[圖3]，由上至下可設的選項分別為

  • 1、是否扣除組內空白值

  • 2、是否以第一個點數值歸零計算

  • 3、原始資料顯示模示 (OD值/透光度%)

  • 4、數據顯示範圍

  • 5、波長計算選項 (設定把原始讀值取Ln)

  • 6、動力學計算選項 (計算Vmax, Onset time, Slope, Max range, Area under curve ... 等)。




【Tips】

Data Reduction：「GFP數值逐點校正」：

本實驗中，每孔的GFP螢光值受到菌液濃度影響，我們可以使用OD600來還原校正GFP讀值：

此處可以在「wavelength option中」輸入custom公式如下

 

！KinPlot @ PlateGFPBottom /！KinPlot @PlateOD600。

 

！KinPlot指令：用以提取符號'@'所引用的原始資料陣列(如OD600的連續讀值)。

原始資料與校正後的結果比較如[圖4]所示。





【Tips】

Data Reduction：「OD數值自然對數轉換」：

細菌是倍數生長，因此將菌液濃度轉換成「自然對數」更能直觀理解濃度。

此處可以在「wavelength option中」輸入custom公式如下

 

Ln（！Lm 1）

 

!Lm1指令：用以提取第一波長所有資料陣列



在「kinetic reduction」下拉選單中,選取Vmax，並設定以“每5個資料點為一組”作計算[圖3]。完成後，雙擊放大檢視，系統會以橙色線呈現計算結果，並顯示數值於下方列表中[圖5-1 & 5-2]。







A1~A5為不同實驗條件組，橙線表示計算Vmax數值的位置



【Tips】

Data Reduction：「計算Vmax最大斜率」

動力學快捷分析(kinetic reduction)是SMP最強大的功能之一，能幫助研究者快速計算出常用的動力學資訊(如表1)。 此處用以計算每個孔的OD600的Vmax來分析不同條件對菌的生長速率的影響。




【Mission 3】運用Group分析及圖表功能顯示組別差異


 

在得到所有單孔的資訊後，我們可以template editor中分組，數據會依設定分配到group表單中，在表單中可依需求自訂計算公式，如Growth rate, Doubling time及Standard deviation等來分析不同實驗組間的差異，並以柱狀圖(Bar graph)顯示[圖5]。



【Tips】

Bar graph：「plot options 資料點選項」

在Graph頁面中，可自由切換Scatter及bar兩種圖形顯示模式，其中Bar graph更適合本實驗用來顯示組別間的細菌生長速率差異。另外，在graph appearance中[圖6]，可以設定更多細節，包括

1、 X軸的顯示形式

2、 是否顯示每條柱的數值

3、 X軸的文字標籤的方向

4、 自訂X軸標籤 (可改為文字)





【更多閱讀】





本文中使用了SoftMax Pro 7中的「Workflow editor」流程編輯精靈、「data reduction」快捷分析功能 、「group analysis」分組分析功能，以及「bar graph」柱狀圖顯示，將完整的細菌生長實驗及所需分析，完整嵌入SMP protocol中，確保原始資料到報告產出可以一氣呵成。

另外，SoftMax ProⓇ具有批次整合管理功能，可引用不同批次的資料進行交叉分析，提供研究者完美的使用體驗。



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參考文獻


[1] https://zh.wikipedia.org/wiki/%E7%97%85%E5%8E%9F%-E7%BB%86%E8%8F%8C

 

[2] ANTIMICROBIAL STEWARDSHIP PROGRAMMES

I N H E A LT H - C A R E FAC I L I T I E S I N L OW - A N D

MIDDLE-INCOME COUNTRIES (WTO)

https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/329404/9789241515481-eng.pdf

 

 [3] Hoogenkamp MA, Crielaard W, Krom BP. Uses and limitations of green fluorescent protein as a viability marker in Enterococcus faecalis: An observational investigation. J. Microbiol. Methods (2015) Aug;115:57-63.






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