【應用專輯】如何替代DAPI染色進行快速活細胞計數?

【摘要】

DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，是常見的DNA染色劑，常用於螢光顯微、染色體擴散，FACS等應用[1-4]。但DAPI的發散波長較寬，易與FITC/GFP通道的檢測產生cross-talk，影響分析結果[5, 6]。另外DAPI染色通常需要固定細胞以達更好的效果。不大合適用於需要長時間觀察的活細胞樣品。本次專輯收集了兩種替代方案供讀者參考。

由Molecular Devices出品的EarlyTox™ 試劑盒。其中Live Red染劑可穿透膜對活細胞的細胞核DNA進行標記，且不影響細胞的活力狀態。另外，Live Red由622 nm激發，645 nm發射亦不影響GFP/FITC通道觀察。

透射光無染色標記(Stain free)

由Molecular Devices出品的SpectraMaxⓇ MiniMax™300細胞成像系統，搭載專利無標記技術，可於軟體中直接智慧辨識透射光影像，對所有細胞進行圈選並計數，可用於單一細胞形態或細胞群體的量分析。

【材料&方法】

CHO-K1細胞通過兩倍稀釋，以20,000到300個細胞每孔的密度種于96孔盤中，37°C培養過夜後，部分細胞用4%多聚甲醛（溶於PBS中）37°C固定30分鐘。

• 固定結束後用PBS清洗兩遍後用0.1% Triton X-100處理5分鐘。進一步用PBS清洗兩遍後用2.9 µM DAPI （溶於PBS中）染色30分鐘。染色結束後PBS清洗三遍。
• 剩下的細胞仍然保持活性，並通過活細胞染料進行染色。染料貯存液1:2000用PBS稀釋，然後加到細胞裡，孵育30min。

• 上機MiniMax 300進行影像擷取，記錄透射光（TL）及紅色（CY5）通道。
• 影像透過SoftMax Pro軟體進行辨識及分析。作為對照，相同的影像也匯入ImageXpressⓇ Micro XLS高內涵系統進行分析。

【分析結果】

如圖2所示，對於紅色通道，以SoftMax Pro預設的‘Nuclei’範本進行細胞核的辨識。對於透射光通道，以Stain Free範本辨識。

隨後以分析參數‘CellA’計算細胞數量。結果顯示，無標記細胞計數可以得到和螢光核染計數沒有差異（圖表2），表示透過MiniMax成像系統和SoftMax Pro軟體可以在不需要核染的情況下進行精確的細胞計數。

另一方面也比較DAPI染色的結果如圖3，結果顯示兩種Live Red與DAPI的分析結果也沒有差異。

【結論】

透過本篇實驗顯示，MiniMax StainFree、Live Red技術可以達到與DAPI一樣細胞計數目的，但能更大程度保留細胞活力，並減少研究者操作時間。

因此既有的DAPI染色相關實驗，可以改染Live Red等紅光試劑，以避免對其他螢光通道(如GFP/FITC)的干擾，且無需固定細胞。如果是監測細胞生長、或簡易的計數工作，使用Stain Free技術更可讓研究者在不影響細胞生長、活力的條件下，反覆觀測，得到更直觀有效的結果。

• 利用StainFree技術進行活細胞計數可以更大程度保持細胞活力
• 減少了染色所需要的固定步驟
• 通過避免染色過程，節省時間和經費

引用文獻

1. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/D1306
2. Otto F. 1990. DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. Methods in Cell Biology 33: 105-110.
3. Kapuscinski J. 1995. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry 70(5):220-233.
4. Chazotte B. 2011. Labeling nuclear DNA using DAPI. Cold Spring Harb Protoc; 2011;doi:10.1101/pdb.prot5556.
5. North AJ. 2006. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition.J. Cell Biology 172(1): 9-18.
6. Jez M, Bas T, Veber M, Kosir A, Dominko T, Page R, Rozman P. 2012. The hazards of DAPIphotoconversion: effects of dye, mounting media and fixative, and how to minimize the problem.Histochem. Cell Biol. 131(1): 195-204.

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