【應用特輯】 AI 驅動的健康人類腸道類器官自動化藥物毒性篩選
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摘要 (Abstract)
本研究採用健康人類腸道類器官（HIOs），建立了一套結合 AI 自動化培養與高內涵成像的藥物毒性篩選平台。相較於傳統 2D 模型，3D 類器官能更真實反映臨床藥物引起的腸道損傷。透過 CellXpress.ai 與 ImageXpress HCS.ai 的整合，實現了從種植、加藥到複雜表型分析的全自動化流程，顯著提升了新藥開發中毒性預測的準確性與一致性。
重點：
- 使用健康人類腸道類器官，具備極高生理相關性。
- CellXpress.ai 實現自動化培養與加藥，大幅提升實驗一致性。
- ImageXpress HCS.ai 進行 AI 驅動的高內涵影像分析。
- 可量化毒性、適合高通量篩選，優於 2D 模型。
引言 (Introduction)
抗癌藥物常伴隨顯著的腸道毒性，而腸道上皮對化療的高敏感性更使毒性成為臨床劑量調整的重要限制因素。為了在臨床前更準確預測藥物對腸道的影響，本研究採用健康人類腸道類器官，建立一套兼具自動化與高再現性的毒性評估流程。相較於傳統 2D 細胞模型，類器官具備更貼近人體生理的三維結構與細胞組成，能更真實反映化合物對組織層級的影響。
本平台結合 CellXpress.ai 的自動化培養與加藥功能，以及 ImageXpress HCS.ai 的高內涵成像與 AI 驅動的表型分析，可定量藥物引起的存活度變化、形態損傷與細胞功能異常。整體流程具高通量、低人為操作偏差及高度可擴充性，有助於提升新藥開發中腸道毒性預測的效率與準確性。
圖 1. 人類腸道類器官（HIOs）藥物篩選全自動化工作流。
結果 (Results)
一、健康人類腸道類器官之自動化培養、監測與加藥
我們建立完整自動化毒性篩選流程（見圖 1）：
- CellXpress.ai 負責 AI-driven 之 3D 培養與加藥。
- ImageXpress HCS.ai 進行高內涵共軛焦成像並使用 AI 作最終藥效分析。
類器官先以 CellXpress.ai 系統種植於 96 孔 U-底盤中，並每 24 小時用穿透光監測一次；第 2 天加入抗癌化合物處理。種細胞第 5 天使用 ImageXpress HCS.ai 系統進行活細胞成像，並搭配 Hoechst、MitoTracker Orange 與 Calcein AM 染色。最終端點分析則利用 IN Carta 軟體進行 AI 驅動的表型分析。
在本研究中，CellXpress.ai 可自動進行 Matrigel 種植與培養，每 48 小時自動換液，並每 24 小時取得 TL 影像，以非侵入方式連續監測生長與形態。Matrigel 與類器官的自動化處理向來具有挑戰：Matrigel 凝固快，移液易造成圓頂體積與分布不均，影響最終分析。CellXpress.ai 具有冷卻模組，可在 50–80% Matrigel 條件下維持液態，並允許使用者自訂流速與混勻次數。本次採用 96 孔 U底盤，簡化種植與成像步驟（圖 2）。
圖 2. 使用 CellXpress.ai 進行類器官自動化培養與監測的軟體流程設定。
CellXpress.ai 能在約 50 顆/μL 的起始濃度下，將類器官精準種植至 96 孔 U底盤，從圖 3 顯示初始分布均勻、孔內變異極小。培養 5 天後，類器官增殖並形成具腔室的典型球狀結構，對照組每孔約有 75 顆成熟類器官。
圖 3. CellXpress.ai 使用穿透光（TL）進行非侵入式連續生長監測。
後續加藥採三階段自動化流程（圖 4）。
- 加藥：將化合物溶液加入類器官孔盤，包含 8 種化合物、7 點序列稀釋。
- 培養：培養箱中與藥物處理 3 天。
- 染色：向每孔加入 50 μL 染色液，由軟體的 Feeding 步驟執行，再以 PBS 清洗。染劑為 Hoechst（細胞核）、MitoTracker Orange（粒線體）與 Calcein AM。
圖 4. 使用 CellXpress.ai 系統進行加藥、培養與染色及 PBS 清洗自動化流程。
二、加藥後之類器官表型變化
染色後立即以 ImageXpress HCS.ai 進行即時成像，10X、共軛焦模式，Z 軸以 8 μm 間距擷取 18 層（約 136 μm 深度），並以 2D Maximum 投影進行分析（圖 5）。之後我們亦以 Alexa488‑Phalloidin 固定並標記細胞骨架完整性；但以下數據均來自活細胞影像。
圖 5 顯示不同化療藥的影響差異。SN-38、Doxorubicin 與 Staurosporine 造成強烈毒殺效應，類器官結構破壞且無法存活；而 Taxol 與 Etoposide 維持類器官形態，呈現細胞抑制狀態；Mitomycin C 則同時呈現兩類結果。
圖 5. 使用 ImageXpress HCS.ai 之 60 μm 針孔共軛焦轉盤、10X 物鏡、掃描 160μm 的 Maximum 投影影像，展示不同藥物處理下的表型差異。
三、影像分析：分割與分類
IN Carta 提供進階特徵擷取，包含 SINAP 的深度學習分割、Phenoglyphs 的機器學習表型分類。依 Calcein AM 與 MitoTracker 的強度判定每顆細胞為陽性或陰性。統計每顆類器官中的陽性與陰性細胞數，並量測陽性細胞平均面積與平均強度；再以四參數曲線擬合繪製濃度效應並計算 IC50（0.06–100 μM），曲線擬合與 IC50 以 SoftMax Pro 軟體完成。
影像分析中最具挑戰的步驟是物件分割，研究者需要將影像切分為具生物意義的區域，如類器官、細胞核或細胞。我們使用 SINAP 進行分割，初始模型以 20–50 張人工標註影像訓練，並以 Segment Anything Model (SAM) 輔助訓練與提升準確度（圖 6）。SAM 可大幅簡化標註，只需點選標的物，軟體即依相似像素延伸至邊界完成分割。
圖 6. 使用 InCarta 軟體的 SAM 功能進行類器官邊界分割，左圖為原始影像，右圖為使用 SAM 一鍵分割的結果。
完成物件偵測分割後，使用多參數分析流程，獲得類器官各形態特徵：包含各螢光強度、形態（面積、圓度、周長）、紋理（顆粒度、對比）以及空間分布……等共 117 項。據此結果，再進行後續表型分類。
Phenoglyphs 是一款基於機器學習的影像分析工具，用於樣品的表型分類，能依影像定量特徵分類各形態差異，適用於細胞、組織或類器官。在本研究中用 Phenoglyphs 對藥物處理之人類腸道類器官作進階表型分類：先以無監督分群，將類器官依表型相似度自動分為 20 群；再由使用者進行監督式訓練並定義各類別名稱，最終將類器官分兩大類：
- 完整 (Intact)：體積較大、形狀圓整、Calcein AM 與粒線體訊號高。
- 受損 (Damaged)：體積較小或結構破碎、Calcein AM 或粒線體訊號降低。
經多輪訓練與視覺確認微調（圖 7）後，模型可對整個資料進行一致性分類。
圖 7. 使用 InCarta 軟體的 Phenoglyphs 功能進行藥物作用之類器官分類。
最終分類輸出各表型類別的百分比分佈（例如 SN-38：0.5% 存活、99.5% 受損），可用以評估濃度依賴效應，繪製劑量反應曲線並計算以表型為基礎的 IC50（圖 8），反映顯著形態或存活改變所對應之濃度。相較單一讀取，該分類同時考量形態與訊號情境，因此更為穩健。
圖 8. 藥物序列稀釋毒性圖表。(A) 顯示由機器學習定義的存活（完整）類器官百分比的濃度相關性。
此外，將機器學習與單一參數（Calcein AM）結果相比（圖 8A），Doxorubicin、Etoposide 與 mitomycin C 的毒性量測上出現明顯差異。Calcein AM 的 Positive Area Sum 反映類器官內的活細胞面積，雖然數值下降意謂存活度降低，但在中等濃度下，類器官結構仍可能維持完整。此差異來自 Calcein AM 強度明顯下降，但類器官在形態上仍完整。機器學習分析因同時考量多種特徵，能反映整體的「受損」表型，而非僅僅是單一強度下降。
此外，我們亦能以機器學習區分細胞抑制（cytostatic）與毒殺（cytotoxic）效應。細胞抑制是指增殖受抑（呈現較小但完整、存活的類器官），而毒殺則指細胞死亡（呈現破碎、解體或死亡的類器官）。使用 Phenoglyphs 的表型分類可將類器官分為三個具生物意義的類別：存活、毒殺、細胞抑制（圖 9）。SN-38 與 staurosporine 顯示明顯的結構破壞；相對地，etoposide 與 mitomycin C 主要呈現細胞抑制效應，僅在最高濃度下出現毒殺效果。
圖 9. (A) 使用 Phenoglyphs 將類器官分為存活（live）、細胞靜止（cytostatic）及細胞毒性（cytotoxic）三類。(B-D) 展示每一類別的代表性影像：存活（綠色）、細胞抑制（藍色、粉色）與毒殺（紅色）效應。存活的類器官較大且完整；細胞抑制的類器官較小但仍保持完整；具細胞毒性的類器官則呈現破碎或結構受損。
🚀 How Molecular Devices Empowers This Research
本研究展示了一個結合 3D 類器官生物學與 AI 視覺分析的高效率毒性評估平台。這類複雜的實驗流程得以實現，核心在於整合了自動化與高解析成像技術：
- CellXpress.ai: 全自動化細胞培養系統，解決 Matrigel 種植難題，提供 24/7 自動化監測。
- ImageXpress HCS.ai: 獲取組織級別的高清共軛焦影像，具備卓越的高內涵成像能力。
- IN Carta: 讓非 AI 專家也能透過 SAM 與 Phenoglyphs 輕鬆進行深度學習分析。
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