【智慧化製造2.0】如何準確篩選克隆，加速細胞株開發進程
【引言】
圖 1 基因表達盒示意圖。編碼治療蛋白和 EGFP 報告基因的 DNA 通過內部核糖體進入位點 (IRES) 連接，因此它們在同一 mRNA 中轉錄，獨立地翻譯成兩種蛋白質。
細胞培養和轉染
- 使用 125 mL 搖瓶在 37℃，5％ CO2、70-80％ 濕度和 125rpm 搖動下，培養FreeStyle CHO-S細胞懸浮生長。
- 生長培養基為 XP CHO Growth A 培養基。
- 將tr-IL15-IRES-EGFP plasmid電轉入細胞。添加3 % ClonaCellTM-CHO ACF supplement，協助轉染細胞恢復。
- 48-72h 後，轉染的細胞在 XP CHO Growth A 培養基中以 3-5x105 cells/ mL 的活細胞密度重新接種，該培養基中添加了 4 mM L- glutamine和 100 ug/mL ZeocinTM 試劑。
螢光輔助分選和克隆篩選
分選前 24 – 48 小時，將細胞以 5x105 cells /mL 的濃度接種在新鮮 XP CHO Growth A 選擇培養基中，並加入 300 ug/mL Zeocin 。
在分選當天，使用 CloneSelect Single Cell Printer( F.Sight) 分選 60 µL 單細胞懸液，其活細胞數為 1x106 /mL 。將按大小，圓度和平均螢光強度分類的細胞以每個well一個細胞的密度分選到預先配置好完全培養基的標準 96 well 盤（Corning 3300）中。
完全克隆培養基是不含 Zeocin 的 EX-CELL®CHO 克隆培養基，其中添加了 4 mM L- glutamine和 2.5％ CHO ACF supplement。
在分選後第 0、1、2、7 和 14 天，使用 CloneSelect® Imager拍攝，驗證單細胞來源的克隆。將確認的單細胞克隆依次從 96 well盤擴充到 24 well，6 well 盤和搖瓶中，從此時起，將克隆維持在無 Zeocin 的 XP CHO Growth A 培養基中，並補充 4 mM L- glutamine。
蛋白質生產分析
對於細胞生長和克隆穩定性研究，每 3-4 天以 1x105 cells/ mL 的濃度重新接種細胞。
對於所有其他搖瓶分析，將細胞以3x105 cells /mL 的濃度接種在 20 mL 補充 4 mM L- glutamine的 XP CHO Growth A 培養基中。在接種後的第三天收穫條件培養基。將所有培養基樣品離心以除去細胞和碎片，然後在 -80 ℃ 下保存。
通過 ELISA（ab218266，Abcam）測定 tr-hIL15 蛋白效價，並在接種開始時和最終樣品收集時間點測量總細胞數，以計算比生產率（SPR）。
SPR 以每細胞每天產生的蛋白為單位（pg 細胞-1 天 -1:pcd）計算生長速率和生產率 5 ， 這為評估和比較細胞株提供了更全面的方法。
【結果】
使用F.Sight 螢光輔助分選法預測克隆治療性蛋白效價
使用CloneSelect Single-Cell Printer (F.Sight)特定分選出EGFP表現量高的單細胞。以相對螢光單位 (RFU) 定量每個細胞的平均螢光強度，根據細胞的 RFU (EGFP 表現量) 將細胞分為四組 (A，B，C，D)，與具有低 EGFP表現量的 A 組相比，具有高 EGFP 表現量的 B–D 組中觀察到的相對 trhIL15 蛋白質表現量平均增加了 2.9–4.4 倍。
此結果顯示通過選擇性分離螢光強度較高的細胞，我們可以去除單細胞分選階段表現低的細胞，並在克隆早期將資源優先分配到蛋白表現量較高的細胞上。
圖 2(A) 具有中高 EGFP 表現量的 B-D 組相對蛋白表達的平均水準為 319±57.3 µg / L 至 477±124 µg / L (mean ± sem)，較 EGFP 表現量低的 A 組要好，高 2.9 至 4.4 倍。樣本量 A：n = 22；B：n ＝ 23。C：23; D：n ＝ 12。(B) 將十二個代表性克隆按比例放大到 125 mL 搖瓶中。這些克隆擴增前 3 天的蛋白產量與 96 well盤擴增前 21 天的蛋白產量呈正相關 (r=0.89)。
為了評估細胞早期蛋白質產量(96 well盤) 和後期在搖瓶中的效價之間的相關性，我們將C組的12個克隆擴充到搖瓶中。
接種後第三天，從這些搖瓶中收集培養基，接種密度為每毫升 3x105 個活細胞，並通過 ELISA 定量 tr-hIL15 蛋白的表達 ( 圖 2b )。
96 well盤中單細胞克隆的 21 天蛋白質產量與125 mL 搖瓶中克隆的 3 天蛋白質產量相關 (r = 0.89) 。
但是D組中具有最高 EGFP 表現量和最高平均蛋白質表現量的細胞不能很好地擴展， 十二個克隆中有四個在擴展過程中死亡。(資料未顯示)
克隆穩定性評估
在開發治療性蛋白質時，評估克隆穩定性是細胞株開發的關鍵步驟。ICH Q5D guidelines6 要求生物製藥廠商進行穩定性試驗以確保一致的產品品質，前提是一致的細胞應產生一致的產品。
對於一次生產運行，從細胞池到生產生物反應器的細胞擴增的平均時間線約為 60 代，因此通常會設計相同時間的克隆穩定性試驗。
我們選擇了克隆 2G11，這是搖瓶研究中效價最高的克隆之一，用於穩定性測試。在圖 3a 中，克隆2G11 在連續繼代過程中顯示出穩定的細胞生長。
在圖 3b 中，重複測量了 SPR，從 0.201 到 0.157 (pg cell-1 day-1)，在試驗過程中損失了-0.044 (-22％ )。通常，在試驗過程中生產率損失( 此處通過 SPR 測量 ) 小於 30％ 的克隆將被認為是穩定的。
如圖 3a-b 所示，克隆 2G11 具有穩定細胞生長和產出蛋白質的特徵，表示該克隆可能是提出進一步表徵的良好候選者。
【展望】
本研究建立了製備高效能治療性重組蛋白的 CHO 細胞株方法。快速選擇性地分選螢光表現量高的單細胞，可以在克隆的早期階段去除不需要的克隆，提高效率。選擇性篩選克隆後，具有高 EGFP 表現量的克隆平均生產率提高到 0.174 pg cell-1 day-1，比未分選的細胞群 (0.032 pgcell-1 day-1) 高出 5.5 倍左右。
此外，由於這種方法不依賴於所表達的治療蛋白或報告蛋白的特異性抗體，它可以很容易地應用於任何細胞株開發過程中。【產品推薦】
CloneSelect Single-Cell Printer F.Sight | 高通量單細胞分離系統
>80%分離效率，提升細胞活率，防止交叉污染。
採用專有的噴墨式一次性的單向分離槽，輕柔而高效地分離單個細胞。
高解析明視野及螢光成像，每個單細胞事件可自動連續拍攝5張佐證圖像。
Molecular Devices全方位專業支持，自動化與單株驗證解決方案。
參考文獻：
Global Therapeutic Proteins Market Report 2020
https://www.businesswire.com/news/home/20191223005228/en/Global-Therapeutic-Proteins-Market-Report-2020-Market-was-Valued-at-93.14-Billion-in-2018-and-is-Expected-to-Grow-to-172.87-Billion-through-2022---ResearchAndMarkets.com
Browne SM, Al-Rubeai M. Selection methods for highproducing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 2007 Sep;25(9):425–32.
CloneTech Laboratories, Inc.; pIRES Vector Information.Protocol No. PT3266-5, Version No. PR59976， 2005
Davies MV, Kaufman RJ. The sequence context of the initiation codon in the encephalomyocarditis virus leader modulates efficiency of internal translation initiation. J Virol. 1992 Apr;66(4):1924–32.
Brezinsky SCG, Chiang GG, Szilvasi A, et al. A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity. J Immuno Meth. 2003 Jan;277:141–155
ICH Q5D Derivation and characterization of cell substrates used for production of biotechnological/biological products
留言
張貼留言