【應用專輯】快速上手雙報導基因檢測方法 (Dual Reporter Gene assay)
報告基因(reporter gene)是研究真核基因表達的常見工具，市面上常見的雙冷光素酶報導基因檢測系統(Dual-Luciferase® Reporter Assay)為常用的基因活性檢測工具。此類雙冷光素酶系統會同時檢測螢火蟲(Firefly)和海腎(Renilla)冷光素酶發光值，消除常見的轉染細胞效率以及細胞數等變異。FlexStation 3為具有移液功能的新一代多功能微量盤式分析儀，同時進行移液加液和讀取數值的方式可為此種高通量雙冷光素酶系統提供一個強而有力的測量平臺。
兩種冷光素酶的反應如下所示。螢火蟲冷光素酶氧化冷光素(luciferin)時，依賴ATP和Mg2+輔助催化。海腎冷光素酶氧化腔腸素(coelenterazine)的氧化，則不需要ATP和 Mg2+。
利用這種特性，測量完螢火蟲冷光素酶表達量後，加入Stop&Glo®試劑會同時中止螢火蟲冷光素酶反應，並誘發海腎冷光素酶作用發光。SoftMax® Pro軟體可設定自動擷取兩組冷光訊號，並自動分析生成反應曲線，計算兩組冷光酶的表達量。
可簡易更換 8 或 16 通道移液頭，適用 96 和 384 孔盤的檢測。
使用小型注射器可降低dead volume，節省試劑。
一次性吸頭減少了每次加液和每次實驗之間的交叉污染風險。
加液後的震盪功能有利於低體積檢測的樣品混勻。
系統也提供如自訂加液高度、加液速度等參數，輕鬆優化檢測流程。
軟體中可跟據實際需求，對同一個孔格設定多次加液，方便迅速測量加入激動劑和拮抗劑後的訊號。
以Firefly 和Renilla luciferase標準品檢測為例
【材料】
Dual-Luciferase® Reporter Assay系統試劑盒(Cat# E1960,Promega公司) Passive lysis Buffer, PLB 5X, Luciferase assay buffer, LAR II, Luciferase Substrate, Stop & Glo® substrate 50X 和Stop&Glo® buffer。
1 mg/mL firefly luciferase (Cat# 9506, Sigma)溶解於含有 1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS並分裝冰凍至 -70℃ 待用。需要時，解凍一管並用 990 μL PLB 稀釋 10 μL 儲存液製成 10μg/mL 標準品。
10 μg/mL recombinant Renilla luciferase (Cat#4400, Novalite, hemicon International)由 10 μg/管溶於990 μL PLB製成。
96或384孔白盤透明底的TC 處理聚苯乙烯盤(Polystyrene Flat Bottom plate, Cat#3604 & 3707, Corning)。
【方法】
將 5X PLB用去離子水稀釋成 1X passive lysis buffer。
用 980 μL PLB稀釋 10 μL每 10 μg/mL firefly luciferase和 10 μg/mL recombinant Renilla luciferase被製成dual luciferase工作標準品(每種酶的濃度 =100 ng/mL)。
在PLB中進行連續1/2稀釋，稀釋後的Firefly和Renilla luciferase標準品以 4 個重覆加入到 96 孔盤的孔中。
96 孔盤需要加入 20 μL/孔。384 孔盤加入 5 μL/孔。
根據Promega試劑說明製備LAR II試劑和Stop & Glo試劑。將每種試劑等分成足夠的量加入到合適的 96 或 384 孔盤中以完成檢測。
使用Flex模式，設定同時加入LAR II並讀取Firefly luciferase冷光值。
使用第二步加液，在加入Stop & Glo消除Firefly luciferase發光並引發Renilla luciferase發光的同時繼續讀取冷光值。
(FlexStation 3 的Flex模式設定細節列於表 1)
在FlexStation 3 上進行 96 孔盤的雙冷光素酶檢測
在FlexStation 3 上進行 384 孔盤雙冷光素酶檢測 (加液後震盪)
在 FlexStation 3上進行 96 孔盤雙冷光素酶檢測 (加液後無震盪)
利用FlexStation 3 的FLEX模式在添加試劑後，立即震盪並迅速讀取數值，有效改善 384 孔盤低濃度雙冷光素酶標準品檢測的結果，提供一個穩定而高通量的雙冷光素酶報導基因檢測平台。
搭配SoftMax® Pro軟體可同步自動生成曲線圖形數據，並輕鬆自動計算如曲線下面積和(AUC, Area Under Curve)等分析數據。
除了搭載自動化移液頭的FlexStation 3外，其他如SpectraMax L、SpectraMax i3x、 iD3及iD5等機型也可搭配注射器(Injector)套件，可以小通量測量雙冷光素酶反應。
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