【應用專輯】人類iPSC神經細胞球3D培養和功能機理評估
全球數以百萬計的人受到神經失調的影響，且此數據正在逐步攀升。雖然確切原因還有待釐清，但環境因子是可能的因素之一。為了加速開發更有效、更安全的藥物，越來越需要複雜性更高、具生物相關性、具預測性且以細胞為基礎的平台，藉此從更大範圍的樣品中找出潛在神經毒性因子。為了達到此目的，在此我們介紹由已分化的皮質神經和星形膠質細胞共同組成的人源神經 iPSC 3D共培養平台（iPSC-Derived microBrain® 3D platform）。
3D神經球可產生自發性同步鈣離子震盪（calcium oscillation），且易於偵測，而此進階的神經學平台已經對高通量篩選應用優化過，適用384孔盤格式，並具備高度穩定性。3D神經球的鈣離子振盪複分析的新方法允許對振盪峰進行檢測和多參數表徵，這些振盪峰包括振盪速率、峰寬和幅值、次級峰的表徵、波形不規則性和其他幾個重要讀數。此外細胞和粒腺體毒性評估的高內涵成像，神經球內鈣離子振盪的過程可用包含震盪頻率、波峰間距、震幅和波型的不規則性等來做多參數分析，而細胞和粒線體毒性亦可用高內涵影像進行評估。我們檢測了包括藥物、殺蟲劑、阻燃劑與其他化學物質在內共 87 種化合物的神經毒性，結果顯示57%對神經有影響，顯示iPSC 3D神經球檢測平臺是一種大有可為的工具，可用於評估藥物和環境毒物的潛在神經毒性。
iPSC-Derived microBrain® 3D
StemoniX® microBrain® 3D 實驗平台是一種高通量的三維培養平台，更接近於人腦組織的發育和構成。在這個平台上，人源iPSC神經細胞球直徑約 600 μm，是由生理功能活躍的皮質麩胺酸神經元（glutamatergic）、氨基丁酸（GABAergic）神經元（MAP2 標記，綠色）和星形膠質細胞（GFAP 標記，紅色）共同培養而成。這種平衡的細胞混合促使豐富的突觸的神經網路得以發展，創造一個高度功能性的神經回路。microBrain 3D 球體中的神經元細胞具有生理活性，並帶有易偵測之同步自發鈣離子振盪現象。
● StemoniX microBrain 3D spheroids ●
●FLIPR Penta 系統，配有新型高速相機和新 ScreenWorks® Peak Pro™ 2 軟體模組
● 系統支援對人類 iPSC 來源的心肌細胞和神經元的鈣離子振盪複雜模式的測量和分析。
我們使用 FLIPR Penta 系統上的高速 EMCCD 相機，通過 EarlyTox Cardiotoxicity 試劑組（Molecular Devices）監測細胞內 Ca2+ 濃度的變化，測量神經球 Ca2+ 振盪的模式和頻率。該儀器配備了新的 ScreenWorksPeakPro 2 波峰分析軟體，可以分析和表徵主峰和副峰，以及複雜的振盪模式。
● 3D 神經細胞培養：
microBrain 3D 實驗用的 384 孔盤來自 StemoniX 公司。細胞已先預培養於多孔盤中並經由常溫運送。每孔包含 1 個尺寸均一的 8-9 週成熟人源iPSC皮質神經細胞球，暴露在化合物中 24 小時，或如圖所示。
● 鈣流檢測實驗：
使用 FLIPR Calcium 6 染劑檢測細胞內 Ca2+ 振盪；球體先染色 2 小時再進行量測。
● 細胞染色：
為評估表型變化，對活細胞進行 3 種染料的混合染色：活性染劑Calcein AM（1 μM），線粒體膜電位染劑 MitoTracker 橙色（0.2μM）和Hoechst細胞核染劑（2μM）（所有染劑均來自於 Life Technologies）。
● 通過 FLIPR 系統評估鈣離子振盪 ●
microBrain 3D 中的神經元細胞產生同步自發性鈣離子振盪。我們使用 FLIPR Penta 系統上的快速動力學螢光成像，通過細胞內 Ca2+ 濃度的變化監測神經球 Ca2+ 振盪的模式和頻率，測試已知的神經調節劑，包括 NMDA、GABA 和 AMPA 受體的促效劑（agonist）和拮抗劑（antagonist）；海人酸（kainic acid），鎮痛藥，抗癲癇藥等。
● 動力學模式的分析:數值與變化 ●
在 ScreenWorks Peak Pro 2 軟體中採用先進的分析方法提供 Ca2+ 振盪模式的多參數表徵。這種表型分析允許特徵讀值，如振盪頻率、振幅、峰寬、峰升高和衰減時間以及不規則性。透過測量幾個數值的變化來評估神經元活動調節劑的效果，並使用24個孔做為控制組確認讀值的準確性與變化程度。
FLIPR Penta 系統記錄的鈣振盪訊號軌跡：
● 神經調節劑的表型效應 ●
在不同的時間點測定了一組 20個化合物，包括部分已知的神經元活性調節劑，並計算了化合物效應的 EC50 值。觀察到頻率或其他參數出現與符合預期神經調節劑之參數下降和提升的現象
● 透過高內涵成像評估細胞球形態和活性 ●
利用共軛焦成像和 3D 圖像分析法，研究了化合物對三維神經球體形態和活性的影響。為評估細胞毒性影響，用各種化合物處理細胞 24 小時，然後用 Hoechst 染細胞核、Calcein AM 和 MitoTracker 橙色染劑染活細胞。影像擷取使用 ImageXpress Micro 共軛焦高內涵成像系統，採用共軛焦和 3D 成像模式。然後使用客製化模組編輯器和細胞分類演算法分析影像，用於檢測所有細胞數、活細胞數（Calcein AM 陽性細胞）和線粒體完整的細胞數（Mito Tracker 陽性細胞）。這些分析方法為細胞和球體形態的表徵提供了有效的工具。
● 使用選定一組神經毒性化合物評估神經毒性 ●
此方法有望在體外對化學物質的神經毒性效應進行高通量評估，這將有助於對不同物質進行評估並為進一步的測試確定優先順序。我們測試了 91 種化合物，它們代表了不同種類的有毒化學物質，包括阻燃劑、殺蟲劑、聚芳香烴，並證明了該方法對已知神經毒性物質數量的敏感性。
● 我們開發了此方法，並證明了 iPSC 而來的 StemoniX microBrain 3D 平台用於評估化合物效果的可行性
● 使用已知的神經調節劑和神經毒性物質證明了預期的功能反應。
● 該方法可用於檢測化合物效應和篩選神經毒性化學物質。
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