【微學堂】Z因子解體真書：一次搞懂原理與應用!!

Z 因子(Z-factor)的由來

『HTS技術』(High Throughput Screening, 高通量篩選)是80年代後期發展起來的一種藥物篩選新技術，能夠準確、快速地從大型化學物庫中鑒定活性化合物（“Hits”），逐漸成為新藥開發中重要工具。

檢測中的所有數值都有一定程度的變化範圍，這是由於每種檢測方法的性質、儀器和人為的隨機誤差引起的擾動所造成。客觀上測量變化越小，所選出的 Hits的“真實”可信度就越高。 有兩種指標能用來約略表示檢測的品質：

1：訊號與雜訊的比值（S/N ratio）

2：訊號與背景的比值（S/B ratio）。

S/B的運算式定義為： S/B=mean signalmean background S/B值提供訊號與背景的比值，但無法顯示訊號和背景的變動差異

S/N 的運算式定義為： S/N=mean signal-mean background SD of background 相較於S/B，S/N值有針對背景值的變化作考量，因此在相同平均訊號與背景差異下，背景變動越小則S/N值越高。但S/N值並無考量到訊號的變動。

可是，這兩個指標都無法充分考量樣品和背景測量的變異性以及訊號的動態範圍，因此都不能很好的反映檢測品質。

直到 1999 年，Zhang 等人定義了一個“Z因子”(Z-factor) 作為評量標準，此係數可有效克服上述弱點，更適用於評估試驗品質。

Z因子它還有以下特點：

1：是無因次量(Dimensionless Quantity)的參數，因此適用於不同檢測分析的比較。

2：不僅為比較和評估分析的品質提供了有用的工具，還可用於分析的優化和驗證。

【 Z 因子的方程式 】

通常在驗證HTS 分析時，會將未知樣品與對照組一起進行分析。驗證測試中包含陽性對照組與陰性對照組的多個樣品測試，評估在活性範圍的兩個極端情況下，實驗再現性和訊號變化。其中陽性對照組平均值與陰性對照組平均值之間的差異就是檢測的動態範圍。

Z因子的方程式定義為： Z=1-3(SD of sample+SD of control)|mean of sample-mean of control| Z 因子對資料可變性以及訊號動態範圍都可感應。例如當分子接近零(代表樣品與背景值的標準差極小)，或者當分母接近無窮大(代表樣品與背景平均值差異極大)時，Z因子趨近於1，這是理想的HTS分析，代表此檢測法具有極大的動態範圍、極小的訊號浮動性。

對任何HTS系統，Z因子值的範圍為（-∞<Z <= 1）。Zhang等人給出了一個篩選試驗各自 Z 因子值的簡單比較（表1）。

【 Z’ 因子的方程式 】

Z’ 因子用於分析開發和優化流程中的品質評估，主要衡量試驗本身的品質，無需未知化合物的參與。因此，Z’因子適用於任何試驗的統計特徵，不侷限於HTS檢測。

對於所有具備正常正、陰性對照組的大型資料，都是 Z <= Z’。

例如，如果 Z’ 值很小（負值或接近零），通常表示檢測條件沒有得到優化，或者檢測形式不可行，無法生成有用的資料。

而在藥物篩選實驗中，在相同條件下對相同檢測的 Z’ 和 Z 值進行比較，可以看出化合物庫對檢測的影響。

Z’因子定義為： 影響分析品質的因素不僅包括儀器和實驗條件（如試劑、方法等），還包括日常的環境和不同用戶操作方面的差異，這些對訊號及訊號變化產生影響的條件要進行優化，以確保可正確進行分析，最終能提供有用的資料。在試驗方法的分析開發中，可以僅使用陽性對照組和陰性對照組來進行計算 Z’因子。

如果 Z’ 值大但 Z 值相對較小（ Z’ 和 Z 都大於 0 ），則可能化合物庫或測試濃度需要進一步檢查或優化。因此，

• Z’ 因子適合評估整體試驗品質，

• Z 因子則反映了針對已定義了篩選條件的特定HTS的品質。

單個 Z’ 因子的測量不足以對試驗品質進行最終評估。在實際應用中，應進行三個或更多 Z’因子的測量，最好由不同的操作人員在不同的日期進行，以獲得對總體試驗品質的準確評估。Z’ 因子實驗還可用於跟蹤試驗品質的變化，或確定對試驗不可避免的變化的影響，例如試劑供應的變化。

總體而言，在評估、比較和驗證任何生物試驗法，都可以使用Z因子，尤其是在實驗開發時，Z’因子還可用於分析評估和驗證。

【使用SoftMax Pro 軟體中的Z因子檢測範本】

關於 Z 因子的檢測，在 SoftMax Pro 軟體的程式庫中可以找到相應的範本，路徑是

Protocol Manager> Protocol Library> Assay Development> Z factor Assay Development打

打開範本後，會在說明欄看到對此範本的使用介紹。

在此範本中，Z 因子有兩種檢測形式。一種是需要加入未知樣本，進行 Z 因子的計算；一種是不需要加入未知樣本，只需要陽性對照組和陰性對照組，進行 Z’因子的計算。

下面具體講解如何使用此範本。首先打開 Plate1 ，如果做整盤測試，需要在 setting 裡，更改一下讀盤區域，選擇全盤。

這個範本預設是螢光檢測模式，在實際應用中，可以選擇任何的檢測模式。點擊 OK，退出設定介面。

為了更快速的進行示範，我們直接從Excel複製一組資料進來

需要對資料進行樣品分組，點擊 Template Editor，資料中第一列是陽性對照組，選擇陽性對照組（PosC）後點選確認（Assign）。

第 2-11 列是樣本組，選擇樣本（Sample），樣本組是有濃度梯度的，初始濃度 3000uM，5 倍稀釋。

最後一列是陰性對照組，點選確認、OK，分組完成。

在左側下面的陽性對照組，和陰性對照組的資料表格中，以計算出平均值和標準差。

在樣品表格中，AVG 是訊號值的平均值，SD 是訊號值的標準差，這一組（AvgActivation）是啟動效率百分比的平均值，根據樣品的濃度和啟動效率百分比可以進行曲線擬合。

這個範本中，使用的是四參數曲線(Four Parameter Logistic Curve)擬合，在實際應用中可在擬合方式清單中選擇其它的擬合方式。

在 Results note 裡，可看到Z和 Z’因子的數值，只要 Z 因子和 Z’ 因子大於 0.5，這個實驗方法和測試條件就是成立的。適合於四參數擬合的資料，可以直接得出 EC50 值。

參考文獻

Zhang, Ji-Hu., Chung, T.D.Y. and Oldenburg, K.R., A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.  Journal Biomolecular Screening 4:67-73 (1999).