疫苗我打了，然後呢...

發表：Molecular Devices (HK)

【 前言 】

最近台灣疫情升溫, 診所又出現了施打疫苗的熱潮，但是疫苗到底是怎麼起作用的呢？為什麼注射疫苗之後還需要帶口罩和注意防護呢？國家又為什麼要號召全民接種呢？

所有的問題，全都跟一個它有關——抗體 (Antibody)。

我們接種疫苗的過程，可以理解為就是為這些“識別系統”發送“通緝令”的過程，只有足夠多的人群收到了這份“通緝令”，病毒的傳播才可能被阻斷。

但病毒也不是一成不變的，尤其像新冠病毒這種 RNA 病毒，單鏈RNA具有不穩定性，複製錯誤時不像 DNA 一樣有另一條鏈作為修復的範本，所以容易產生變異。

病毒一旦變異，對於體內的抗體來說，就像是易了容，有些易容沒有遮蓋到他們的特徵（特異性識別部位），拿到過通緝令的抗體仍舊可以將它們識別出來，但如果特異性識別部位發生了改變，抗體就沒辦法認出他們了。如果不小心感染了這類變異株，就仍然有感染發病的可能性。

  

抗體為整個免疫過程中的“識別系統”，而這個“識別系統”本身的“靈敏度”和“追蹤能力”就很重要了，這就是『抗體親和力(Affinity)』。

抗體親和力指的是抗體和抗原決定簇之間的結合力，其大小是評價抗體效果非常重要的指標。測量抗體對特定抗原的親和力，對於篩選抗體十分重要。

在生物藥物研發中，抗體親和力測量意義重大，如單株抗體，測量抗體親和力，可以為適應不同用途選擇單株抗體提供依據，另外測量抗體親和力在早期挑選Hybridoma單株抗體，可以達到節省實驗成本、縮短實驗週期的目的。

親和力是又稱『解離平衡常數 Kd』 (單位 mol/L和濃度單位一致)，是表示可逆反應過程中反應物(ex抗原、抗體)和最終產物(ex抗原-抗體複合物)之間的相對狀態的特徵參數。

親和力的強弱決定了最終決定反應完成時可逆反應各組分相對多少。我們可以通過幾個化學反應案例來做說明。

範例 1：氫氣和氫氣和氧氣在點燃的條件下生成水

	氫氣 H2	氧氣 O2	反應終止後的體系內物質
莫耳濃度	2	1	H2O
莫耳濃度	>2	1	H2O 和 H2
莫耳濃度	<2	1	H2O 和 O2

化學反應進行到底的結果是某一類反應物反應完全，有此類反應的過程和結果特性的反應稱之為不可逆反應。

範例2：PD1 抗原（CD279）和 PD1 抗體（如 Pembrolizumab）在常溫常壓下反應。

這是生物學反應的過程，既有生成複合物的正反應過程，也有複合物解離生成抗原，抗體的逆反應過程，最終形成複合物，抗原，抗體共存的狀態。

	抗原 （CD279）	抗體 （Pembrolizumab）	反應終止後的體系內物質
莫耳濃度	200  nM	100 nM	抗原-抗體複合物97.86nM 抗原 4.28nM/ 抗體2.14nM
莫耳濃度	100 nM	200 nM	抗原-抗體複合物 49.8nM 抗原 0.38nM/ 抗體159.89nM

當一個可逆反應中正反應和逆反應的速度相等時，反應體系中抗原的濃度、抗體的濃度和抗原-抗體複合物濃度不再增加也不再減少，可逆反應完成，反應體系中各成分莫耳濃度處於動態平衡。

目前常見的幾種抗體親和力的檢測方法包括：生物膜干涉技術（ BLI ）、固相放射免疫法（ SP-RIA ）、平衡透析法、結合抗原沉澱法、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)等。

1 ） 生物膜干涉技術：

生物感測器底端有固定的分子組成的生物膜，有垂直光射入生物膜層時會形成一定波長的干涉波。當固相分子與溶液中分子相互作用時，生物膜層厚度增加，干涉光譜會向波長增加的方向移動，檢測儀器可根據位移檢測出感測器表面的分子數量變化及濃度等資料。

2 ） 固相放射免疫法：

用抗原包被微板，加入系列稀釋的定量單株抗體，溫育至反應平衡後洗去未結合的抗體並加入同位素標記的二抗，通過放射性的強度按照公式可得親和力常數。

3 ） 平衡透析法：

利用半透膜將配體分子隔在小室一側，抗體放在另一側，隨著時間的推移，配體會透過半透膜進入抗體一側結合，在達到平衡時可利用公式計算得到親和力常數。

4 ） 結合抗原沉澱法：

將單價抗原與抗體在同溶液中進行孵育，在反應達到平衡後用 50% 飽和硫氨酸或 15% 聚乙二醇進行沉澱，再分離游離與結合抗原測定濃度，並按照公式測定之。

  

雖然目前用於抗體親和力的實驗方法眾多，但是用於最廣泛的還是ELISA (酵素結合免疫吸附分析法)。因為該技術簡單，快速，不需要複雜昂貴的實驗儀器，且實驗中需要的抗體和抗原量較少。

單價抗體的抗體親和力檢測 ELISA 檢測抗體親和力的原理是通過檢測抗原抗體混合物達到平衡以後的自由抗體的濃度（實驗中採用恆定抗體濃度，梯度抗原濃度） 在抗體為單價的情況下，自由抗體和抗原抗體複合物之間達到平衡狀態時，可應用以下方程： Ii：可變抗原濃度    r0：恆定抗體濃度   ci：抗原抗體複合物 如果 Ii>> ci ,通過簡單的代數換算可用下面公式計算得到 Kd 值或者 Ka（結合常數，Ka=1/Kd）：  A0：I=0 時的光吸收值   Ai:  I=i 時的光吸收值 以上方法僅適用於單價抗體，但是抗體至少有兩個結合位點，如果抗原決定簇中的一個位點造成了另一個抗原分子結合抗體的空間阻位，此時可認為它是一個相互制約的單價抗體。

雙價抗體的抗體親和力檢測 考慮到雙價抗體的實際情況，在計算時要對 2.1 （上文）中的方程進行修改，應使用下述方程做計算：

競爭型 ELISA 檢測抗體親和力的實驗流程 a. 在微量盤上coating抗原，室溫靜置2小時，PBS 清洗。 b. 將不同濃度的抗原溶液加入到恆定濃度的抗體溶液中，抗體濃度不超過 0.5 μmol/L ，    總體積為 100 μl 。 c.室溫靜置30 min 後，取 90 μl 的反應混合物加入a中，並預先加入buffer 30 μl 後靜置育，不宜超過 10 min 以避免混合物中的反應平衡體系被破壞，導致結果不準確。完成後進行清洗步驟。 d.加入二抗，靜置1小時， PBS 清洗 e.加入顯色劑，顯色 30 min 後加入終止液停止反應，放入微量盤式分析儀內進行讀取OD值。 抗原濃度較低時，反應平衡後，微量盤上捕獲游離抗體多，信號強；當抗原濃度較高時，微量盤上捕獲的游離抗體少，信號弱。即可使用此原理檢測抗原的濃度

參考文獻：

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