【COVID】利用全自動化設備加速重組蛋白疫苗與中和抗體開發
疫情肆虐超過一年，COVID對生命及生活威脅仍未消除，如何加速疫苗及治療藥物的開發，是人類對病毒戰爭中最重要的課題。Molecular Devices作為生命科學研究陣營的一員，將與您併肩作戰，提供最佳的服務和工具，加速相關的研究發展。
本文將著重在重組蛋白疫苗開發和篩選中和抗體的自動化解決方案，逐一介紹免疫抗原發現和改造、噬菌體展示技術(Phage display)和雜交瘤技術(Hybridoma)的抗體開發、以及重組蛋白/抗體生產用細胞株開發的工作流程。
不同的疫苗開發平臺(比如滅活病毒與DNA疫苗)需要的工作流程不盡相同，各有各的優勢。CEPI(Coalition for Epidemic Preparedness Innovations)以及其他類似機構，在全球性流行病中推動多樣化的對策以增加對抗感染源的成功率。這裡，我們重點介紹利用重組蛋白作為免疫原開發疫苗的通用工作流程，以及Molecular Device能提供加速您研究工作的系統。
1.篩選免疫原
採用Phage display篩選病毒抗原，發現潛在的疫苗候選物。
2.免疫原表徵分析
免疫原性狀研究確認上述步驟發現的抗原是否能激發免疫反應。
若所選抗原能成功激發免疫反應(常用ELISA檢測)，這個抗原即可被認為候選免疫原而繼續進行更多的表徵工作， 並且在後續的蛋白質改造工程中將此目標屬性引入免疫原。
3. 蛋白質(免疫原)改造工程
免疫原的一些屬性會導致注射入動物或人後出現不良反應。因此，需要使用一些基因編輯工具，如CRISPR/Cas9，改造免疫原的DNA基因，從而消除這些屬性。
4.細胞轉染和建立克隆
DNA序列優化完成後，需要放大免疫原的生產用於後續測試。在這個階段，構建高表達、單株源性的細胞株非常關鍵。這個階段涉及基因工程、轉染以及單細胞克隆，尤其是採用哺乳動物細胞株作為宿主細胞。
5.篩選表達量和品質屬性
在單細胞克隆後，監測細胞的生長並評估表達量。純化並製備免疫原用於動物注射以激發免疫反應。待動物產生抗體後，通過病毒中和試驗評估疫苗效力。
Phage display是一種用於研究展示於噬菌體表面的蛋白與另一個分子如peptide、DNA或者其他蛋白質相互作用的技術。Phage display常用於發現抗原抗體之間的高親和相互作用，這在發病機制研究、疫苗及其他治療方法開發中發揮關鍵作用。
1.淘洗
淘洗是一個富集(enrich)高親和力噬菌體的重覆過程。
2.單株挑選
經淘洗篩選到的噬菌體，長成克隆後被單獨挑取，以分離每個獨特的結合蛋白。
3.抗原抗體相互作用
淘洗階段，展示高親和力蛋白的噬菌體從低親和力噬菌體中被篩選出來。這個定性的篩選過程需要用定量的免疫分析驗證以評估抗原抗體的相互作用，比如ELISA、免疫螢光、HTRF，補體結合實驗、凝集反應和/或沉澱反應等。
4.功能篩選
通過抗原抗體相互作用的表徵後，常使用於細胞實驗，針對候選分子的功能活性做進一步篩選(如病毒中和實驗或疫苗效力)。
Hybridoma技術是將分泌抗體的B細胞與永生化的骨髓瘤細胞融合，用於大量生產抗體的一種技術。因為B細胞分泌不同的抗體，因此需要對hybridoma做單細胞克隆從而得到一個大型的單克隆抗體庫，這常常被用於預防、診斷或治療疾病。
1.細胞融合
將表達特異抗體的B細胞與骨髓瘤細胞融合得到hybridoma的過程。
2.單株篩選
發現特異性或高表達抗體的單克隆源性的hybridoma。
3.細胞生長分析
利用無標記成像技術，在一段時間內監測細胞增殖從而評估細胞生長。
4.特異性和親和反應
分析抗體與目標抗原結合的能力。
5.結合親和力和內吞化
"結合親和力"指示生物分子(如蛋白質或DNA)與其配體或結合物(如藥物或抑制劑)的互相結合的強度，監測目標顆粒進入細胞的能力。
細胞株開發是一個建立單株性的細胞群體的過程，用於在一段時間內表達所需特徵(比如生產重組蛋白)。當單個細胞增殖形成克隆後可對其性狀開展評估。
1.穩定轉殖
細胞株開發流程的起點是將外源DNA(編碼目標重組蛋白)導入宿主細胞，這個過程即為轉染。轉染後，細胞會在短暫的一段時間(通常不超過一周)內表達外源蛋白，最終完全停止表達。但是，其中的小部分細胞會維持長時間表達重組蛋白的能力，這是由於外源DNA整合至其基因組中。它們是穩定轉殖細胞，被挑選出來後進入下一步實驗。
2.細胞池富集化
編碼感興趣蛋白的外源DNA還包含篩選基因，可用於將穩轉細胞從未轉染細胞中篩選出來。比如將綠色螢光蛋白(GFP)加到外源DNA中，這樣轉染的細胞會呈現螢光，可以與未轉染的細胞(沒有螢光)區分開來。重組蛋白的表達量與GFP訊號強度存在強相關性，因此研究人員可以利用GFP訊號強度發現並富集高表達的細胞。
3.單細胞分離
穩定轉殖的過程，不管是靶向的還是隨機的，都會產生表達量不同的異質細胞群。因此，必須分離和克隆單個細胞以保證細胞群體的基因一致性，從而顯著降低表達的異質性。單細胞分離是一個從實體組織或細胞懸液中分離出單個活細胞用於後續分析的過程。
4.單克隆性驗證和細胞生長分析
單細胞克隆是細胞株開發中非常關鍵的一步。確認在微量盤中分離出單個細胞非常重要，且通常需要使用細胞成像系統記錄。形成克隆後對細胞繼續監測分析其生長，從而確認其生長屬性沒有顯著變化。這是一個追蹤單個細胞生長變成克隆的過程。
5.表達量和關鍵品質屬性篩選
檢測細胞表達的重組蛋白或抗體的濃度及其他指標。
1. QPix 微生物株篩選系統
QPix 400系列微生物株篩選系統結合機械視覺和精確自動化用於快速高效地篩選大型微生物庫。
● 快速3000株/小時挑取，簡化工作流程。
● 除了微生物株篩選，系統還可以自動化多個樣品準備和微量盤操作步驟，比如轉移菌液至瓊脂盤然後塗佈。
● 具備資料追溯和分析模組，QPix系統的軟體可以協助控制和管理複雜且重複的過程。
2.ClonePix 2 哺乳動物細胞株篩選系統
● 多樣的檢測功能
系統自動採集明視野及螢光通道，以明視野分選單株的形態、尺寸以及株間距離；以螢光篩選蛋白表達量或特異性，一步完成分選及驗證流程。
● 維持無菌環境
內建全套清洗消毒功能，包括儀器內部滅菌的紫外燈，挑針清洗和高溫鹵素燈。
● 微量盤儲存功能
內建兩組10盤的堆盤架，分別用於存放源盤(source plate)和終盤(orientation plate)
● 形成離散株
CloneMatrix半固體培養基有助於單細胞形成離散株。半固體培養基可獲取更高密度的克隆用於篩選。
● 無動物來源成分
CloneMedia有助於提高產量；CloneDetect則可用於染色分泌的抗體。
● 可與週邊設備自動化整合
專業的AWES團隊針對用戶的工作流程，進行定製、改造或自動化整合週邊設備。
3.CloneSelect C.sight/F.Sight高通量單細胞分離系統
● 原位細胞分離影像
系統會對每個單細胞分離事件連續採集五張影像，可作為單細胞性依據。
● 螢光影像和分選
可用活細胞染劑挑選螢光高表現量的表達細胞，或是利用GFP分離感興趣的細胞 (如CRISPR基因編輯)。
● 超微流體技術
專有的「矽基微體控晶片」可精準產生pico liter級的液滴來包裹細胞，只有符合條件的細胞被接種至微量盤。
● 無標記(label free)成像和分選
基於細胞直徑和形態分選細胞，可接種1-100個細胞至微量盤。
● 相容多種細胞類型
多種細胞類型，如CHO、HEK293、L929、T細胞以及B細胞等都可以被接種。細胞直徑範圍5-40μm。
● 無菌分離槽
採用獨立包裝的無菌分離晶片，避免細胞樣品接觸污染及交叉污染。每個分離晶片可以完成數十盤以上的接種工作。
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