【Tech Note】運用自動化水鏡系統提升高內涵影像精度與品質

【前言】

在面對如3D培養、神經再生或是高密度培養這類會形複雜生物影像的實驗中，如何採擷到最佳對比的影像成為後續分析的關鍵步驟。本文將探討使用『自動化水鏡』是否幫助使用者輕鬆達成此一目的

【材料&方法】

• 本文中的所有測試均在96/384 孔盤或市售的器官晶片(organ-on-chip)盤中進行。

• 測試中使用空氣鏡或水鏡的實驗流程都相同，包括雷射自動對焦等環節。

• 此外，我們用低倍物鏡對全微孔盤拍攝，自動辨識稀有目標樣品後，使用高倍的水鏡自動重新成像。

【實驗耗材】

• Corning® spheroid microplates (384 well 格式)

• Mimetas OrganoPlate® 3-Lane

• InSphero Akura™ 384 孔盤

• Greiner SensoPlate™ - 96 與 384孔盤

【細胞】

• 3D InSight™ 腫瘤微組織（InSphero）

• HUVEC（人類原生內皮細胞）

• HCT-116（人類結腸直腸癌細胞）

• Caco-2（人類結腸直腸癌細胞）

• PC-12（大鼠神經母細胞瘤細胞）

【時間有限的人，可以先看結論】

【更多結果】

1、粒腺體的完整性和融合性試驗

使用rotenone和chloroquine處理而得劑量反應曲線，來進行粒線體融合和膜完性試驗。

粒線體的形成和完整性對於了解疾病機制與毒性評估很重要。

粒線體的長度、亮度和數量會在粒線體回收(recycling)、代謝或凋亡過程中改變。

通過 MetaXpressⓇ 軟體中的形狀工具來確定成像後光強度和粒線體顆粒，工具中可自訂標準來測量“顆粒性(granularity)”、“纖維數(fibers)”或“區塊(segmentation)”等參數。

這些參數可以用於計算各種化合物的劑量效應和有效濃度。

圖2. 用chloroquine（粒線體回收抑制劑）和rotenone（氧化磷酸化抑制劑）在指定濃度下處理 PC12 細胞 24 小時。

1. 用 MitoTracker Orange CMTMRos（黃色）和 Hoechst（未顯示）染色，再用40X 水鏡和非水鏡分別拍攝影像。

2. 使用 MetaXpress 軟體分析，辨識“顆粒性（左）”或“纖維數（右）”

3. 分割區塊遮罩圖顯示了完整的顆粒、纖維或區塊定量，計算 EC50（四重複樣品）

4. 水鏡可以提高影像品質，更準確地計算顆粒數，進而獲得更高的Z值。

 

2、器官晶片 (Organoid)

拍攝血管新生抑制劑處理之3D 血管新生器官晶片

 

水鏡提高不平整樣本的解析度和球形度，對器官晶片研究是一大優勢。此處對MIMETAS OrganoPlate 3-Lane模型晶片上的腸道和血管新生樣品進行成像。

圖3-A、依照Mimetas 提供步驟培養 Caco2 細胞，形成完整的管狀模型。用 Hoechst 和 phalloidin (conjugated with AlexaFluor-488 ) 對細胞進行染色，並進行Z軸共軛焦掃描成像。使用40倍水鏡拍攝的底層（左）和頂層（右）影像。

圖3-B、拍攝Phalloidin-AlexaFluor 555、Hoechst 和anti-VE cadherin染色的 HUVEC 細胞的血管新生模型，用 20X水鏡拍攝50層 z 軸的2D投影顯示未處理的細胞（右）和抗血管新生化合物處理的細胞（左）。

 

3、三維掃描（Quick ID、靶點成像）

化合物處理 HCT116（結腸癌細胞）生成之腫瘤球(spheroid)的細胞死活試驗。

 

對細胞球活力的定量測量

3D 腫瘤模型越來越多地用於癌症研究。在此範例中，我們計算從 HCT116 結腸癌細胞培養形成的3D球體的細胞死活率，來評價藥物對腫瘤球的毒性作用。

圖5. 用 4000個HCT116 細胞在 U 型底 384 孔盤中的培養形成細胞體。抗癌化合物處理48小時候用 Hoechst 和 EthD-1 染色3小時

（A）使用20X 物鏡（水鏡或者非水鏡）對孔盤進行共軛焦成像

（B）將11張10um間隔的影像進行Z軸掃描並進行Maximum演算法平面投影，然後使用細胞核定量模組或客製化分析模組分析。使用細胞核或活細胞的數量來計算EC50作為化合物評估。由於使用水鏡對整個球體中細胞的定量更加精確，因此得到更大的Z值。

【結論】

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