【應用專輯】自動化縮時成像完成血管新生評估

 

導言

血管新生，即由現有血管形成的新血管的過程，是與脊椎動物發育和傷口癒合有關的重要生理現象。在嚴格的自我恆定調節下，血管新生的過程受到促進血管新生和抗血管新生分子的作用控制。而破壞此恆定調節已被證明在多種疾病中扮演重要腳色。1 血管保護或血管新生過程不足涉及多種退行性疾病，如心肌梗塞、神經退行性疾病等。4血管增生或形態的異常亦與許多疾病有關，如癌症、慢性發炎和黃斑部病變。1,3-5

開發各種以細胞為基礎來研究血管新生的方法，如促進和抑制血管新生化合物的作用，對於開發治療癌症、缺血性心臟病和其他疾病的藥物至關重要。成像方法對於評估血管新生很重要，因此使用穩定且精確的成像系統和軟體來適當地擷取、分析和量化這種複雜的生物學過程是非常關鍵的 。

我們使用共培養血管新生模型，包含正常人真皮纖維母細胞(human dermal fibroblasts)和表現GFP(Sartorius IncuCyte® 血管新生96 孔試劑組)的慢病毒感染人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)，示範以ImageXpress® Pico 自動細胞成像系統來定量評估血管新生。以非連續活細胞縮時攝影方式，來評估促進/抑制血管新生化合物隨時間對HUVEC血管新生管形成的劑量依賴性(dose-dependent effect)。亦使用自動影像定量的多種參數，進行錯綜複雜的血管網絡分析。

【關鍵技術】

➤	利用活細胞縮時攝影觀察血管網絡成型。
➤	使用內建血管新生分析模組進行HUVEC細胞定量。
➤	產生多參數評估血管新生網絡，包括長度、面積以及數量分支、區段(segment)和連接集(connect set)。

 

【實驗材料】

• IncuCyte 血管新生96 孔試劑組(Sartorius，Cat. # 4452)，包含：
• 正常人真皮纖維母細胞(NHDF)
• 人類臍帶靜脈內皮細胞，表現CytoLight Green (HUVEC CytoLight Green)培養液
• IncuCyte 血管新生試劑組VEGF / Suramin試劑組 (Sartorius，Cat. # 4437)
• 96 孔透明底黑盤 (Greiner，Cat. # 655090)
• Rapamycin ( Thermo Fisher Scientific Cat. # PHZ1235 )
• Molecular Devices ImageXpress Pico自動化細胞成像系統和CellReporterXpress® 自動拍攝與分析軟體

【實驗方法】

血管新生分析方法

血管新生試劑組中提供正常人真皮纖維母細胞和表達GFP 的正常人臍靜脈內皮細胞。

按照試劑組的說明，

1. 將正常人真皮纖維母細胞(NHDFs) 在培養液中解凍並復甦。
2. 之後將含有NHDFs 的離心管在200 x g 條件下離心4 分鐘、去除上清液，並將NHDF 細胞重新懸浮於12 mL 培養液中。
3. 取100 μL 的NHDF 細胞懸浮液到96 孔透明黑盤中，將多孔盤室溫培養1小時，使細胞沉澱。
4. 將表現GFP 的人臍靜脈內皮細胞(GFP-HUVEC) 以每孔100 μL 的濃度種在NHDF 層上面，然後再培養1小時，使HUVEC 沉澱。
5. 將盤子放入37 ℃ 培養箱中4小時，然後在ImageXpress Pico 系統中獲得第0 天的讀值。次日，移出舊培養液，並在每孔加入150μL 培養液。
6. 接著在第2天進行第一次化合物刺激，在第4天和第7天分別進行第2次和第3次化合物刺激。化合物溶液是用預熱的培養液調配。
7. 用血管內皮生長素VEGF 來刺激HUVEC 細胞中的血管新生。
8. VEGF 工作溶液按1：4 稀釋，從16 ng/mL 降至最終濃度0.25 ng/mL。
9. 為了測試已知的抗血管新生化合物的抑制作用，將suramin或rapamycin加入含VEGF的孔中。將suramin和rapamycin的2倍工作溶液與2X VEGF 溶液一起添加到孔中。
10. 血管新生抑制劑以1：4 稀釋，每孔中VEGF 的最終濃度為4 ng/mL。
11. Suramin的最終濃度為80 μM至1.25 μM，rapamycin的最終濃度為1.2nM 至0.018nM。

 

自動化活細胞成像

1. 使用整合式環境控制的ImageXpress Pico 系統，在5% CO2、20% O2、85% 濕度和37 ℃進行活細胞成像。
2. 在ImageXpress Pico 系統中進行非連續式縮時攝影拍攝，拍完一個時間點就放回培養箱中，到下一個成像時間點再上機進行拍攝。
3. 培養1小時後拍攝第一個時間點、12小時候拍攝第二個時間點、24 小時拍攝第三個時間點。然後在接下來的9 天中，每24 小時拍攝一次。
4. 在明視野和FITC 通道中，以10 倍物鏡於每個孔拍攝9個位置，總和相當約35％總面積。
5. 透過使用“ 無縫拼接流程”，無需手動操作就能即時拼接影像。
6. FITC 通道影像在200ms曝光下，使用即時2D 澄清化(deconvolution)成像。
7. 明視野影像的曝光時間為10ms。

 

自動化影像分析

1. 利用CellReporter Xpress 軟體內建的血管新生分析模組來辨別測量血管新生的網絡發展。
2. 用戶只需輸入簡單幾個參數，分析模組即可在準確分割全部HUVEC細胞分裂、生長與血管形成的影像。
3. 此分析是為了辨識大於4 μm 長而細的微血管優化而成( 圖1 和2 )。
4. 這種最小寬度的界定是為了讓非血管的小細胞與碎片被誤算而設計。
5. 而代表HUVEC細胞分裂與增生的大細胞團塊則被判定為細胞結(node)( 圖1D )。
6. 此外，能得到有效判定促進/抑制血管新生藥效的各樣參數，包括平均與總的血管長和麵積，每組管長，節點數，區段數和分支點。

本應用文章展示每組管長，以說明VEGF 和抗血管新生化合物對HUVEC 細胞管形成的影響( 圖2 和3 )。

 

Figure 1 使用ImageXpress Pico 系統自動成像並分析血管新生。(A–B) 在明視野影像中，可看見共同培養的纖維母細胞和HUVEC 細胞，而FITC 通道可用來觀察表現GFP 的HUVEC 細胞影像( 綠色)。(C–F) CellReporter Xpress 軟體中的血管新生分析模組在整個縮時實驗中辨別並測量血管網絡的形成。分析模組辨別新生血管( 白色)、網絡骨架( 橙色)、分支點( 藍色)，以及分裂和生長的細胞團( 紫色) (D，F)。

 

【結果與討論】

血管內皮生長素刺激血管新生

監測促進血管新生因數的作用對於開發抗缺血性疾病的藥物與瞭解血管新生在發育和傷口癒合中的作用具有重大意義。包含關鍵的生長素在內，基礎訊號傳遞分子調節著血管網絡的生長和分佈2,3 。

在本活細胞體外實驗中，我們使用已知為內皮細胞關鍵促進血管生長因數的VEGF 刺激血管新生。起初HUVEC 細胞顯現出基礎的血管生長和成形，並在加入VEGF 後立刻有反應。在第2天加入以及後續的每次添加VEGF後，血管長度均出現明顯增加的峰值( 圖3 )。

但是，對於最高濃度的VEGF(16 ng/mL)，添加第7 天后每組血管長度的增加無顯著差異。 16 ng/mL 和4 ng/mL VEGF 對血管網形成的刺激最大，而最低的兩個濃度有60% 和40%刺激效果。

Figure 2 血管新生網路的刺激與抑制。HUVEC 細胞第10 天的代表性影像( 左) 與對應的血管網絡影像分析遮罩圖(右，以白色呈現)。為了測試抑制化合物對VEGF 刺激網絡形成的影響，在第2 天、第4 天和第7 天加入了4 ng/mL VEGF 的suramin和rapamycin。

Suramin和rapamycin抑制血管新生

抑制血管新生一直是各種疾病治療發展的重點，包括各種癌症、發炎和退行性疾病，目前市場上有幾種抗VEGF療法，用於治療某些癌症和年齡相關性黃斑部病變。3

為了展示VEGF 參與的血管新生的抑制作用，我們測試了加入4ng/mL 的VEGF下兩種間接血管新生抑制劑的各種濃度抑制效果，包含常見的酪氨酸激酶(tyrosin kinase)抑製劑Suramin以及mTOR 抑制劑Rapamycin。

與4 ng/mL VEGF 對照相比，Suramin和rapamycin都對HUVEC形成血管造成負面影響，導致管長度縮短( 圖2 和3 )。血管新生抑制效果明顯具劑量有關。各測試的濃度都抑制了HUVEC 細胞達到最大值。與4 ng/mL VEGF 對照相比，可看出這些組別的每組管長更小。當suramin的濃度為80 μM時，其抑制效果達到高峰。

Figure 3 測量管長以評估血管新生網絡的形成。使用CellReporterXpress 軟體中血管新生分析模組的每組管長( 以µm為單位的總管長除以連接組的數量) ，用來評估促血管新生因數VEGF (A)，以及抗血管新生化合物suramin(B) 和rapamycin(C) 在濃度增加下的效果。在4 ng / mL VEGF 處理的情況下，將suramin和rapamycin添加到孔中，並將這些化合物的作用與4 ng / mL VEGF 對照組進行比較。進行各濃度四重複測試並取平均值。

【結論】

血管新生在臨床與生物學上的意義，顯明出研究此複雜且動態過程所需體外細胞平台的重要性。

本次提供的資料顯示出ImageXpress Pico 系統能夠準確擷取促血管生成和抑制化合物的效果，同時保持最佳的活細胞環境條件。可靠的分析方法能夠定性和定量血管生成網絡，也因此可以用來研究新型療法對血管生成的影響。

 

參考文獻

1. Li, Tinglu et al. “Tumor angiogenesis and anti-angiogenic gene therapy for cancer.” Oncology letters vol. 16,1 (2018): 687-702. doi:10.3892/ol.2018.8733
2. Matsumoto, Ken, and Ema, Masatsugu. “Roles of VEGF-A signalling in development, regeneration, and tumours.” The Journal of Biochemistry, Volume 156, Issue 1, July 2014, Pages 1–10, https://doi.org/10.1093/jb/mvu031
3. Melincovici, Carmen Stanca et al. “Vascular endothelial growth factor (VEGF) – key factor in normal and pathological angiogenesis.” Romanian journal of morphology and embryology = Revue roumaine de morphologie et embryologie vol. 59,2 (2018): 455–467.
4. Moriya, Junji, and Tohru Minamino. “Angiogenesis, Cancer, and Vascular Aging.” Frontiers in cardiovascular medicine vol. 4 65. 24 Oct. 2017, doi:10.3389/fcvm.2017.00065
5. Nowak-Sliwinska, Patrycja et al. “Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.” Angiogenesis vol. 21,3 (2018): 425–532. doi:10.1007/s10456-018-9613-x