【領讀】走近諾貝爾獎：揭秘CRISPR/Cas的潛力-以CRISPR/Cas法構建Wilson疾病藥物篩選模型

本期文獻介紹

標題：

《人類胚胎幹細胞來源的Wilson病模型篩選藥物療效》

發表平臺：MDPI

發表時間：2 April 2020

【你知道嗎？】

【前言】

　　由遺傳性疾病體細胞誘導而來的 hiPSCs 可以為篩選治療人類遺傳疾病的潛在藥物提供良好的細胞模型。但當患者樣本非常罕見時，這種模型就很難完成。本文作者利用 CRISPR/Cas9 系統在沒有患者樣本的情況下，成功誘導出了 Wilson 病的 hiPSC 細胞模型，打開基因編輯技術直接建立人類遺傳疾病模型的可能性。

　　Wilson 氏病也叫做肝豆狀核變性症，是常染色體隱性遺傳疾病，全球發病率統計約為 1/30,000～1/100,000，致病基因攜帶者約為 1/90。該病在中國較多見。致病基因 ATP7B 突變導致 ATP 酶功能減弱或消失，引起血清銅藍蛋白（ceruloplasmin）合成減少以及膽道排銅障礙，蓄積在體內的銅離子在肝、腦、腎、角膜等處沉積，引起不斷加重的肝硬化、錐體外系症狀、精神症狀、腎損害及角膜色素環等。

　　為了解決這個病需要建立可供研究的細胞模型，本文作者的研究策略如下：

【細讀品味】

1、以 CRISPR/Cas9 基因編輯誘變 Wilson 疾病細胞

　　作者選用了兩種含有 R778L 突變位元點鄰近基因組區域的 single-guide RNA (sgRNA)，並將 2 個 sgRNAs 合併到 px459 plasmid 中，共同表達 Cas9 蛋白和 puromycin resistance gene。為了引入 R778L 的單鏈核苷酸，還設計了包含突變序列（c.2333G>T）和靶區兩側同源序列的單鏈寡去氧核苷酸（ssODNs）。通過 puromycin 篩選出突變株。

為確認細胞群發生了遺傳突變，從每個 clone 中提取基因 DNA，通過 RT-PCR 對目標基因進行測序。在各個 clone 中，證實了 sgRNA -2 轉染組在 c.2333 位點對 T 進行了純合替代（圖 3B）。
該 R778L 誘變克隆表現出典型的 hESCs 形態，並表現 OCT4、NANOG、SOX2 和 SSEA4 等 hESC markers，進一步證實了誘變後的細胞具有自我更新能力（圖 3C 及補充資料 S2）。

2、建立細胞模型：將 hESC 誘導成肝樣細胞( hepatocyte like cells, HLCs）

　　將 WT、R778L 和 Wilson hiPSC 分別轉化為 hepatocyte like cells（HLCs）， WT-HLCs, R778L 突變 -HLCs 和 Wilson hiPSC-HLCs 呈現經典的六方形形態（圖 4A），免疫染色證實，三種不同性質的 HLCs （WT-HLCs、R778L 突變的 HLCs 和 Wilson hiPSC-HLCs）均強烈表達 ALB 蛋白和 CK18，它們是肝細胞的主要細胞標誌物（圖 4B）。

流式細胞實驗：進一步評估了的 HLCs 的純度，結果顯示 99% 以上的細胞在肝標記物 ALB 和 HNF4A 中呈陽性（圖 4C）。
Real-time PCR 分析： ALB、HNF4a 和 CYP3A4（圖 4D）；肝臟標記物的 RNA 測序；轉錄因數；藥物代謝酶；藥物轉運蛋白和 PAS 染色（圖 4E 和圖 S5）進一步證明不同方式分化得到的 HLCs 具有 hepatocyte 特徵。

3、測試 HLCs 模型：與 wild type 和 Wilson 病患者幹細胞誘導的肝樣細胞在銅離子處理下的脆弱性

　　氯化銅對 WT-HLCs 的形態學改變無明顯影響，然而在 R778L 突變的 HLCs 和 Wilson hiPSE-HLCs 中都檢測到大量細胞死亡（圖 5C），這表明對銅離子的高脆弱性是由於 WT 中引入了 R778L 突變導致的。

細胞活力分析進一步支持了這一發現。利用 CCK-8 試劑盒處理各細胞，並使用 SpectraMax iD3（Molecular Devices）光譜分析儀檢測細胞活力，可以看出氯化銅濃度在 20µM 以下時， WT-HLCs 的活力表現平穩，直到高濃度條件下出現了規律的活力下降，而 R778L 突變的 HLCs 活力在 1µM 時就已經出現顯著下調，並且隨著濃度的升高，R778L 突變的 HLCs 和 Wilson hiPSE-HLCs 的細胞活力都急劇下降（圖 5D）。

　　以上結果均說明 R778L 突變的 HLCs 很好的模擬了 Wilson 病肝樣細胞的銅離子脆弱性。

4、以細胞模型進行藥物篩選評估

　　文中使用了三種常用的藥物來進行三種細胞的藥物篩選評估。

D-penicillamine（DPA）、
Trientine hydrochloride Bathocuproinedisulfonic acid（BSC）
DL-α-Tocopherol acetate (一種可能與 Wilson 病相關的抑制氧化應激的藥物)

　　同樣利用 CCK-8 處理細胞，並用 SpectraMax iD3（Molecular Devices）光譜分析儀檢測細胞活力，從圖 6 可以看出，在四種藥物的處理下，R778L 突變的 HLCs 和 Wilson hiPSE-HLCs 均表現出非常類似的回應趨勢。

　　利用 copperGREEN 來標記細胞內的銅離子，隨後使用 SpectraMax iD3（Molecular Devices）光譜分析儀檢測 510nm 處的螢光強度，以此測定胞內的銅離子濃度。

　　結合對胞內銅離子含量的測量資料（圖 7A），更進一步證明在D-penicillamine（DPA）處理下，能夠顯著降低銅離子對 R778L 突變的 HLCs 和 Wilson hiPSE-HLCs 細胞的毒性作用，由此也間接證明了 R778L 突變的 HLCs 是能夠作為 Wilson 病模型細胞來進行藥物治療方面的篩選研究的。
　　本文利用 CRISPR/Cas9 系統，將 ATP7B 基因（c.2333G>T）的 R778L 突變引入wild type 的 hESCs 細胞基因組，引入後的細胞不僅具有正常的自我更新能力及分化能力，且與 wild type HLCs 相比，引入 R778L 突變的 HLCs 對過量銅的上升表現出更高的脆弱性。最後，通過處理 Wilson 病的藥物，進一步證明了 R778L 突變引入的 HLCs 在藥物篩選中的適用性。

 【結論】

　　除了 Wilson 病之外，人類世界尚有近 7000 種罕見病，例如漸凍人症（ALS）、克羅恩病等，有些病甚至在世界範圍內的患病人數不足千人，這更加大了研究的難度。如果能夠將 CRISPR/Cas9 法引入到其他類型罕見病的建模當中，將為人類未來的疾病治癒帶來更多可能。這也正是 CRISPR/Cas9 所帶來的深遠意義。
　　本研究建立的模型能在沒有病人體細胞的前提下模擬 Wilson 病，能提供一個可靠的實驗流程進行後續的藥物篩選研究（圖 8）。


 【CRISPR豆知識】

　　CRISPR 是 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇規律間隔短回文重複序列）的首字母縮寫，是源於細菌及古細菌的一段特殊 DNA 序列，能夠識別入侵細菌的病毒 DNA 或 RNA，並通過特殊的剪切酶破壞入侵的病毒核酸序列，從而達到防禦侵染的目的。

圖 1. CRISPR/Cas 防禦過程示意圖

（編者繪製）

　　在擁有 CRISPR/Cas 系統的細菌基因組裡，

CRISPR 就相當於鑰匙庫，存儲了很多把能識別病毒基因的鑰匙
Cas 就是剪刀庫，Cas 是一個蛋白質家族，能編碼出許多種不同種類的剪刀，它們能剪碎病毒核酸，並將其中某一段片段帶回來，整合到鑰匙庫裡

　　如果下次遇到同種病毒，這時的 Cas 剪刀將帶著之前儲存過的鑰匙，精准打擊病毒，把病毒的核酸剪個稀碎，阻止病毒感染。更厲害的是，這個鑰匙庫是可以遺傳的，細菌在繁衍過程中可以不斷積累和增強這種防禦能力。

【CRISPR的發現】

　　事實上，最早發現 CRISPR 序列是在 1987 年，由日本分子生物學家石野良純在大腸桿菌中偶然發現的，但為什麼是美國分子生物學家杜德納和法國微生物學家卡彭蒂耶獲得諾貝爾獎呢？因為是她們首次純化了 Cas9 蛋白，並證明瞭在體外也能使用 CRISPR 系統切割任意 DNA，從而建立了可以變為基因編輯工具的 CRISPR/Cas9 系統。這項成果發表在 2012 年 6 月的《科學》雜誌上，是最早發表的關於細菌天然免疫系統演變成 CRISPR/Cas9 基因編輯工具的工作。

　　所以 Cas9 正是科學家們從細菌的剪刀庫裡，挑選出的其中一把剪刀，作為該系統裡重要的剪切工具。通常，這把剪刀會被安排進一段嚮導 RNA 中，並與目標 DNA 片段一起導入待編輯的細胞內，然後完成切割-整合的步驟，將目標 DNA 整合進待編輯的基因組中。