做表型分析實驗的你了解 Cell Painting 分析法嗎?

 





  一種新型的高內涵細胞分析方法學,透過 6 組以上染色標定將細胞元件區分,以影像方式加以分析量化,用以作細胞健康、藥理毒性、分子或遺傳干擾等表型剖析。與傳統表型剖析相比,其優點是能提供更全面性的表型圖譜及量化數據,能夠被進一步使用針對性選擇分類或群組分析。


  並為了保持最準確的資訊傳達,我們將在未來 Molecular Devices 發佈的相關技術文章中直接使用 Cell Painting 英文原詞,而不使用中文翻譯詞,以避免意義混淆。



【Cell Painting的緣起】



  2016年,由美國哈佛麻省理工的博多研究所(The Broad Institute of Harvard and MIT在 Nature Protocol 期刊上,發表了使用 Molecular Devices 的 ImageXpress 系統建立的高內涵方法學,並命名為“Cell Painting” [1]


  近年來,Cell Painting 在眾多領域得到了廣泛的應用。例如

  • 研究特定基因的功能和途徑,確定基因的相互作用;

  • 研究化合物、藥物、天然產物等的作用機制,

  • 讓藥物篩選更優化;

  • 描述細胞異質性;

  • 從研究基因功能,到確定 SARS-CoV-2 的潛在治療化合物 [5]

  • 評估化合物或環境化學物質對人體生理的影響;

  • 毒理學研究……等等。


  接下來,我們探討如何利用 Cell Painting 的方法進行高內涵表型分析


  Cell Painting 的目的是盡可能“”地觀察分析細胞,以構建表明細胞狀態的代表性影像。本文中的 Cell Painting 的標記了細胞核、內質網、肌動蛋白、高基氏體、RNA(和核仁)以及粒線體。採用配備有 6 通道以上濾鏡組,能不同倍率自動擷取螢光標記的細胞影像,並進行自動影像分析,以辨別、萃取和測量特定的細胞特徵可以大幅加速這些工作。(Figure 1)。


  使用 ImageXpress Micro Confocal 共軛焦高內涵成像分析系統的優點

  • 高度自動化,模組化設計可以簡化 Cell Painting 工作流程。

  • 使用具有學習功能的強力軟體進行客觀的影像分析。

  • 使用介面好上手的網路平台快速分析大型多維度資料集。





【Cell Painting 實戰範例】



  這裡,我們展示一個 Gustafsdottir et al [8] Cell Painting 的高內涵表型分析工作流程。此流程使用 IN Carta 影像分析軟體和 HC StratoMineR™ 資料分析。


  藉此流程,我們發現細胞經同樣的化合物處理而得的表型圖譜是相似的。

  例如,階層式分群法(Hierarchical clustering analysis)將紫杉醇(paclitaxel)和魚藤酮(rotenone)等劇毒化合物分在同組。同一分類中,氯奎寧(Chloroquine)和粉防己鹼(tetrandrine)都影響細胞自噬 [7,9]


  結果證明,此高內涵表型分析圖譜工作流程是一個好用、準確且強大的方法。




【實驗方法】


1、細胞培養

  根據製造商提供的步驟,對 U2OS 細胞系(ATCC)進行繼代和培養。根據 Bray et al [6] 提供的方案來實施 Cell Painting。

  • 將 U2OS 細胞種在 Greiner 384 孔 U 底透明盤中,每孔 2000 個細胞,共 40µL McCoy 培養液(補充10% FBS),在 37℃ 培養 24 小時。


  • 使用 2% FBS 含量的 McCoy 培養液,替換之前的細胞培養液。


  • 添加化合物,以下列舉 11 種需要用到的化合物:

    • Ca-074-Me,CCCP,chloroquine(Enzo), cytochalasin D, etoposide(Calbiochem), latrunculin B, rapamycin(Sigma),rotenone (Enzo),staurosporine,paclitaxel,and tetrandrine(除非另有說明,所有化合物均購自 SeleckChem)。

    • 化合物分別按照 1:3 的梯度稀釋,產生 7 個不同的濃度處理,每個化合物濃度處理的樣本作 4 重複。在同一多孔盤中同時作 DMSO 對照組,陰性對照組和陽性對照組。化合物作用時間為 24 小時。


2、細胞染色

  • 活細胞使用 MitoTracker DeepRed(最終濃度500nM) 在暗房中 37℃ 培養 30min,然後使用 3.2% PFA 固定細胞,作用 20min。在室溫下使用 triton-100 (0.1%),作用 20min。

  • 染色液配置成以下的濃度:

    • 5 µL/mL phalloidin, 100 µg/mL concanavalin A, 5 µg/mL Hoechst, 1.5 µg/mL WGA and 3 µM SYTO 14 dye ,溶於 blocking solution(1X HBSS and 1% wt/vol BSA)。

  • 在室溫下清洗細胞並加入染色液作用 30min。

  • 染色完畢後,移除染色液並清洗細胞 3 次,然後用錫箔紙包裹避光保存。

    • 所有的細胞清洗步驟均使用 1X HBSS 溶液.


3、細胞拍照

  • 使用 ImageXpress® Micro Confocal 系統進行細胞成像。

    • 使用 20X Plan Apo 物鏡,共軛焦針孔尺寸 60 µm;

    • 使用的螢光通道為:DAPI 377/447,FITC 475/536,TRITC 543/593,TexasRed 560/624,Cy5 631/692。

    • 每孔拍攝 4 個視野。每個視野進行 3 層小範圍 Z 軸掃描,

    • 再利用最佳聚焦投影(Best focus)方式產生最終影像,藉此解決可能影響影像對焦的盤底平整度問題。


4、影像特徵擷取

  • 利用 IN Carta 軟體進行影像分析。影像處理策略如下:

    • 以 Hoechst 染色細胞核為主要目標,採用自訂分割演算法對影像中染色目標進行分割(預設為細胞核的模型),接觸到照片邊緣的目標被排除在計算中。

    • TRITC 通道使用 Robust 選項對細胞進行分割。

    • 三個額外的細胞器分類方法使用指定選項:Mitochondria (networks), actin(fibers)and endoplasmic reticulum(networks)。每個細胞總共可以選擇 280 個測量值作為資料輸出。


5、資料分析

  • 在影像特徵擷取完畢後,細胞的資訊被匯出成 CSV 檔,與有化合物資訊的詮釋資料(metadata) text 檔一起上傳到 HC StratoMineR(CoreLife Analytics)。使用 StratoMineR 介面來定義全盤概覽圖。

    • 使用品管欄位,將狀態異常(outlier)的孔(少於50顆細胞)從分析中排除。軟體通過特徵評分的建議進行資料轉換。

    • 使用主成分分析(PCA)用於資料整理。

    • 由於產生的 15 個成分用以評估模型的距離評價,是用來衡量不同處理下細胞的表型效應程度 [11]

    • 模型的距離評價可用於針對性選擇或聚類分析。


【結果】


  實驗共使用 11 種化合物處理細胞,其中一些已經在之前的 Cell Painting 研究中作為參考化合物 [10]。化合物處理後,對細胞中胞器進行染色,包括粒線體、肌動蛋白、高基氏體、核仁(RNA顆粒)、內質網(ER)和細胞核(Figure 2)。


  透過深度學習分割模組(SINAP)加入分析流程用於改善細胞核的辨識(Figure 3)。SYTO14 染色用於定義細胞質,使用 Robust 選項的細胞分割方法來進行分析。實驗同時還對內質網,粒線體和肌動蛋白進行了識別和分析。另外,實驗還從整個細胞,細胞核和細胞質的所有通道進行總螢光強度的測量。




  在設定影像分析時,我們觀察到該模型改善了細胞核偵測能力,並讓相鄰細胞核能更準確分割。

  在 IN Carta 軟體中能容易檢視分析結果,熱點圖和柱狀圖等選項亦可用於一般資料探索。單細胞(cell-by-cell)與整體(summary)樣品的各項分析數據均可用 CSV 格式檔匯出,並可用於進一步的資料探索和分析(Figure 4)。




  由 IN Carta 運算完結果輸出至 HC StratoMineR 雲端伺服器作進一步的資料分析。此實驗使用主成分分析法將 280 個分析數值縮減為15個主要參數。接著使用階層式分群法(Hierarchical clustering),將 well 間的關係呈現於樹狀圖中(Figure 5)。


  用相同化合物處理的細胞傾向於聚類在一起,如第 9 群是僅由 staurosporine 處理的細胞組成。已知具有相似細胞效應的化合物也分群在一起,如 Cytochalasin D 和 latrunculin B,兩種肌動蛋白聚合抑制劑均在第 6 群中發現。已知影響自噬途徑的粉防己鹼和氯奎寧也同在第 5 群。這些結果顯示,驗證了以高內涵為基礎的高度自動化、智慧化的表型分析方法,是可行且易於實現的。


【討論】


  總體而言,本文的結果提供了一個良好的範例,驗證 ImageXpress Micro Confocal IN Carta StratoMineR 的整合方案,確實可以應用於如 Cell Painting 般的高通量影像基礎的表型圖譜分析。


點擊圖片可查看詳細內容

ImageXpress Micro Confocal

IN-Carta

StratoMineR

系統適用于高內涵成像和 Cell Painting。

軟體將簡便性與高級特徵分割功能(SINAP)相結合,以實現對細胞特徵的準確且客觀的辨別。


雲端平臺讓非資料專家使用者,能因直覺化引導流程能快速執行表型資料分析。


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參考文獻:

[1] Bray M-A, Singh S, Han H, Davis CT, Borgeson B, Gustafsdottir SM, et al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nat. Protoc. 2016;11:1757– 74.

[2] Wawer MJ, Li K, Gustafsdottir SM, Ljosa V, Bodycombe NE, Marton MA, et al. Toward performance-diverse small-molecule libraries for cell-based phenotypic screening using multiplexed high-dimensional profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2014;111:10911–6.

[3] Gustafsdottir SM, Ljosa V, Sokolnicki KL, Anthony Wilson J, Walpita D, Kemp MM, et al. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 2013;8:e80999.

[4] Caicedo JC, Singh S, Carpenter AE. Applications in image-based profiling of perturbations. Curr. Opin. Biotechnol. 2016;39:134–42.

[5]Svenningsen, E. B., Thyrsted, J., Blay-Cadanet, J., Liu, H., Lin, S., Moyano-Villameriel, J., … Poulsen, T. B. (2021). Ionophore antibiotic X-206 is a potent inhibitor of SARS-CoV-2 infection in vitro. Antiviral Research, 185, 104988. doi:10.1016/j.antiviral.2020.104988

[6]  Bray MA, Singh S, Han H, Davis CT, Borgeson B, Hartland C, Kost-Alimova M, Gustafsdottir SM, Gibson CC, Carpenter AE. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nat Protoc. 2016 Sep;11(9):1757-74. doi: 10.1038/ nprot.2016.105. Epub 2016 Aug 25. PMID: 27560178; PMCID: PMC5223290.

[7] Gong K, Chen C, Zhan Y, Chen Y, Huang Z, Li W. Autophagy-related gene 7 (ATG7) and reactive oxygen species/extracellular signal-regulated kinase regulate tetrandrine-induced autophagy in human hepatocellular carcinoma. J Biol Chem. 2012 Oct 12;287(42):35576-88. doi: 10.1074/jbc.M112.370585. Epub 2012 Aug 27. PMID: 22927446; PMCID: PMC3471698.

[8]  Gustafsdottir SM, Ljosa V, Sokolnicki KL, Anthony Wilson J, Walpita D, Kemp MM, Petri Seiler K, Carrel HA, Golub TR, Schreiber SL, Clemons PA, Carpenter AE, Shamji AF. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 2013 Dec 2;8(12):e80999. doi: 10.1371/journal. pone.0080999. PMID: 24312513; PMCID: PMC3847047.

[9]  Mauthe M, Orhon I, Rocchi C, Zhou X, Luhr M, Hijlkema KJ, Coppes RP, Engedal N, Mari M, Reggiori F. Chloroquine inhibits autophagic flux by decreasing autophagosomelysosome fusion. Autophagy. 2018;14(8):1435-1455. doi: 10.1080/15548627.2018.1474314. Epub 2018 Jul 20. PMID: 29940786; PMCID: PMC6103682.

[10]  Nyffeler J, Willis C, Lougee R, Richard A, Paul-Friedman K, Harrill JA. Bioactivity screening of environmental chemicals using imaging-based high-throughput phenotypic profiling. Toxicol Appl Pharmacol. 2020 Jan 15;389:114876. doi: 10.1016/j.taap.2019.114876. Epub 2019 Dec 30. PMID: 31899216.

[11]  Omta WA, van Heesbeen RG, Pagliero RJ, van der Velden LM, Lelieveld D, Nellen M, Kramer M, Yeong M, Saeidi AM, Medema RH, Spruit M, Brinkkemper S, Klumperman J, Egan DA. HC StratoMineR: A Web-Based Tool for the Rapid Analysis of High-Content Datasets. Assay Drug Dev Technol. 2016 Oct;14(8):439-452. doi: 10.1089/adt.2016.726. Epub 2016 Sep 16. PMID: 27636821.

[12] Rohban MH, Singh S, Wu X, Berthet JB, Bray MA, Shrestha Y, Varelas X, Boehm JS, Carpenter AE. Systematic morphological profiling of human gene and allele function via Cell Painting. Elife. 2017 Mar 18;6:e24060. doi: 10.7554/ eLife.24060. PMID: 28315521; PMCID: PMC5386591


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