高密度無支架式3D腫瘤球之高通量腫瘤毒性研究

【簡介】

　　與傳統的2D培養模型相比，3D腫瘤球(3D cancer spheroid)模型因為能夠更佳模擬生物體內的組織結構、基因表達和代謝情況而越來越受歡迎1,5,6。先前的研究顯示，3D培養能表現出多種體內腫瘤特徵，如細胞與細胞或細胞與細胞外基質(ECM)交互作用、藥物穿透率、藥物反應與抗藥性7。與實體腫瘤相似，腫瘤球由外層細胞增生區、中層靜止細胞和內部處於缺氧狀態的壞死核心細胞組成。這些相似之處表明3D模型將有助於更好地評估藥物安全性，並有助於成功挑選出抗腫瘤化合物4。

　　針對培養3D細胞球已經開發出各樣的技術，不外乎使用『抗細胞附著表面』或『物理性促進細胞與細胞的交互作用』這兩類方法。

『旋轉培養瓶法』(NASA生物反應器系統)採用連續轉動來防止細胞粘附在培養瓶表面，從而促進細胞與細胞之間的粘附。
『磁懸浮法』利用磁場將含有奈米顆粒的氧化鐵細胞團簇在一起形成球狀體。而旋瓶法和磁懸浮法會產生大量的細胞球，均勻性差、球形體比例低2。
『懸滴法』是將細胞懸浮液滴在培養皿的底部。然後將液滴中形成的球狀體轉移到細胞培養盤中進行進一步的檢測。但這項技術耗時耗力，若無自動化系統協助，只限用於小範圍內研究和應用。

　　當前則更盛行使用鍍有低貼附性材料的『U形底微孔盤』，這種無支架的方法提供了相對簡單的工作流程，細胞球尺寸易於控制、球體的均勻度高2，但缺點是在每個孔中只能生成一個細胞球。因此需要使用很多孔來增加資料量，不但耗時且大幅增加試劑和測試化合物的篩選成本。通常會結合併用one step染色法及高內涵技術來優化工作流程，以有效減少分析時間及誤差3

　　如對通量有更高的要求，可以考慮採用如『康寧®Elplasia®微孔盤』(6孔、24孔、96孔)。其在盤內設計有微腔，並在底部處理極低貼附性塗層，以利形成細胞球。與標準U底盤相比，Elplasia 96孔盤平均每個孔可生成>78個球體。這允許在相同的條件下生長和處理更多細胞球，進一步發揮高內涵的資料輸出能力。特別適合用於研究腫瘤組織的異質性，增加用於基因表達或代謝組學分析的材料數量5,8。

　　本文將演示Elplasia 96孔盤的應用以及完整的3D細胞分析流程，包括前端細胞球培養/生成、化合物/染色處理、及後端以ImageXpress® Micro Confocal進行影像擷取與MetaXpress® 3D的毒理分析。提供研究者整合工具的成功案例，希望能為您在藥物開發和毒理研究方面帶來重大突破。

優勢

• 輕鬆增加每個實驗條件下的細胞球數量

• 大量的細胞球可同時培養、染色和成像

• 使用高內涵成像，同時對多個細胞球或類器官進行3D分析

【方法】

細胞培養

　　使用HCT116細胞株生成細胞球。預濕Elplasia盤並根據製造商提供流程進行處理。將50,000個細胞種在含100毫升McCoy培養液(含10%胎牛血清)的Elplasia 96孔盤中。細胞在37℃下培養24小時，讓加藥前能形成細胞球。

　　在加入化合物之前，細胞先用一般顯微鏡觀察，驗證細胞球的形成。本實驗使用以下化合物：Cytarabine、doxorubicin、etoposide、staurosporine及紫杉醇(taxol)。化合物按照1:5序列稀釋，和對照組一起進行雙重複測試。細胞球與化合物共培養六天，新鮮化合物在第三天加入。

染色

　　對於活細胞毒性實驗，細胞球用以下染劑染色，最終濃度如下：

3μM的Calcein AM(Life Technologies)
2μM的EthD-III(Molecular Devices)
33μM的Hoechst 33342(Life Technologies)

　　在使用前配製染劑溶液，每孔加10μL。在成像前，細胞球在37℃的染劑中培養2.5小時。

影像擷取

　　使用ImageXpress® Micro共軛焦高內涵影像系統(Molecular Devices)進行影像擷取，共軛焦轉盤的針孔尺寸=60μm、使用10X物鏡。拍攝12層Z-stack影像，Z軸間距為5μm，至少擷取一半的細胞球體積。

分析

　　使用MetaXpress軟體中的客製化分析模組(CME)進行3D影像分析。

在Hoechst染色影像中使用3D功能之“Find Spherical Objects”演算法辨識球體，再使用細胞核計數模組識別細胞總數。
『活/死模組』用於定量死亡細胞(EthD陽性)和活細胞(Hoechst陽性，Eth陰性)的數量。因為死細胞可能不再顯示Hoechst染色，
『細胞分類別模組』用於識別所有EthD陽性細胞。利用最優匹配演算法將所有平面上的總細胞、活細胞和死細胞的物體Mask連接起來形成三維物件。
使用SoftMax®Pro軟體使用4參數logistic曲線擬合進行劑量反應分析。
統計分析和圖表用Microsoft Excel完成。

結果

　　典型的無支架細胞球成型的方法是使用超低貼附U型盤，每個孔產生一個細胞球。為了增加資料點需要重複檢測多個孔，這通常費力且大幅提高篩選成本。Elplasia的96孔盤可以在一個孔中形成多達78個細胞球，一個微腔一個球。在這些微腔槽中形成的球體在大小和形狀上是一致的，因此提高了實驗再現性(圖1)。該盤與ImageXpress高內涵成像系統相容，允許根據所使用的檢測方法進行不同的生物資訊讀出。

　　細胞球用不同抗癌藥處理6天，然後評估細胞存活率。用Hoechst(細胞核)、Calcein AM(活細胞染劑)和EthD(死細胞染劑)染色(圖2和圖3)。為了減少對球體的干擾，簡化染色過程，染劑留在孔中不清洗。

　　為了量化藥物處理對細胞存活率的影響，我們使用在MetaXpress軟體中3D分析功能的客製化分析模組(CME)對影像進行分析。測量細胞球直徑、體積、死細胞和活細胞數。

　　觀察化合物處理的細胞毒性和細胞抑制作用。總體而言，所有化合物都造成的活細胞數量(EthD陰性)下降、死細胞(EtHD陽性細胞)數量增加，特別是staurosporine和doxorubicin處理後，表現出細胞毒性。在紫杉醇和etoposide在測試濃度的作用下，細胞總數減少，顯示出細胞抑制效果(圖4C和4D)。

　　在處理過的細胞球中觀察到活細胞的濃度依賴性下降。Cytarabine、doxorubicin與cytarabine的處理引起具濃度相關的活細胞數下降、死細胞數相應增加。紫杉醇處理的細胞球顯示球體的尺寸縮小，但活細胞數沒有減少，表明細胞抑制作用。在較高的紫杉醇濃度(13.3μM)下觀察到細胞毒性，同時活細胞數減少3倍。

　　通過測量球體的直徑和體積，我們還評估了化合物對球體大小的影響(圖4B)。有趣的是，經化合物處理的細胞球（Cytarabine、doxorubicin、staurosporine和紫杉醇）與對照樣品相比直徑沒有顯著差異。然而，與對照組相比，處理後的球體體積明顯減少。減少球體體積而不減少直徑表明一個球體結構坍縮，三維形態不再保持。由於直徑可以通過二維分析來測量，體積和直徑的差異表明三維分析對於研究化合物毒性對球體的影響更具有代表性。

　　雖然球形活細胞的數量可以用來測定引起表型變化的化合物的有效濃度，但3D分析的其他檢測參數可以提供關於特定影響的額外資訊（例如死亡細胞的數量、總細胞數量和螢光強度）。

【結論】

　　結合共軛焦高內涵技術與能形能大量細胞球的培養系統，能大幅提昇研究通量，解決U型微孔盤的欠項。透過優化的工作流程及軟體分析，可有效定量評估化合物對球狀體的效應，提高異質性組織的更佳的研究樣品數，加速以3D培養為基礎的高通量藥物篩選/開發。

參考文獻：

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3. Sirenko O, Mitlo T, Hesley J, LUke S, Owens W, Cromwell EF. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cUltUres. Assay DrUg Dev Technol. 2015;13(7):402–414

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6. Santini MT, Rainaldi G, Romano R, et al. MG-63 hUman osteosarcoma cells grown in monolayer and as threedimensional tUmor spheroids present a different metabolic profile: a (1)H NMR stUdy. FEBS Lett. 2004;557(1- 3):148–154.

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