【應用專輯】不能錯過！快速驗證 CRISPR 編輯細胞的好方法

 

【簡介】

2020年10 月 7 日諾貝爾化學獎揭曉，由法國生物化學家艾瑪紐埃爾·沙爾龐捷（Emmanuelle Charpentier）和美國化學家珍妮佛·杜德納（Jennifer A. Doudna）共同獲得，用以表彰兩位女科學家發現了基因工程上開創性的成就。她們共同開發出的CRISPR/Cas9基因剪刀，是目前最犀利的基因編輯工具之一。研究人員可以使用CRISPR/Cas9精準地改變動物、植物和微生物的基因片段，此一工具已徹底改變了生命科學領域，可廣泛地使用在植物育種、遺傳疾病治療、癌症治療等不同領域。

藉此機會，我們來聊一聊CRISPR/Cas9基因剪刀，並推薦一種檢驗方法，瞭解CRISPR/Cas9進行的細胞編輯是否能如你所願。

 

什麼是CRISPR/Cas CRISPR是『常間回文重複序列叢集（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）』的縮寫，Cas是CRISPR相關蛋白家族的簡稱，兩者共同組成了一套系統，目前推測是細菌/古細菌中用來抵抗病毒和外源質體的天然防禦系統。當外源基因入侵時，該防禦系統的CRISPR序列會轉錄生成能與入侵基因組序列相識別的RNA，引導CRISPR相關酶（Cas）在序列識別位點切割外源基因組DNA，從而達到防禦目的。 根據Cas蛋白的特點，CRISPR/Cas基因剪刀分為三種類型，其中Ⅱ類最為簡單，僅藉助Cas9蛋白和gRNA（guide RNA ）即可完成目標核酸的識別和剪切，準確性較高，操作容易，所以CRISPR/Cas9自從被發現以來，迅速成為了一種非常流行的基因編輯工具。

【前言】

CRISPR/Cas9發揮作用主要有三個步驟：

1.  外源DNA序列插入到CRISPR序列的間隔區

2. 形成tracrRNA/crRNA複合物：CRISPR轉錄生成與外源基因匹配序列的前體crRNA（CRISPR-derived RNA），該crRNA再通過鹼基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結合成複合物。

3. 此複合物引導核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點進行雙股DNA剪切。

 

研究者可以設計改造crRNA和tracrRNA成為具引導作用的 gRNA（guide RNA），從而引導Cas9對宿主細胞雙股DNA的定點切割（圖 1）。

隨著DNA雙鏈斷裂後，細胞會經歷兩種DNA修復途徑：非同源性末端接合（non-homologous end joining, NHEJ）途徑和同源性重組（Homologous Directed Recombination, HDR）途徑。在沒有DNA模板（DNA template）的情況下，可通過NHEJ隨機插入或剃除（insertion or deletion, InDel）鹼基造成基因失活；有DNA模板的情況下，可通過HDR的方式在剪切位點引入目標修飾基因，實現基因的定點插入和替換[1]。

檢驗基因編輯的效果

為了確定插入的突變是否成功或降低了目標基因數，基因組PCR和基因定序是常用的檢測手段。或是直接檢測下游蛋白的表達，避免來自基因結構內缺失和編碼的突變，是更有效檢驗方式[2]。

在本文中，研究者使用ATG5 Human Gene Knockout Kit（CRISPR）剔除HEK293細胞中自噬（autophagy）相關的ATG5蛋白，並插入綠色螢光蛋白（GFP）和抗嘌呤黴素基因（puromycin resistance genes）。

培養後透過SpectraMax i3x搭載MiniMax™ 300細胞成像系統來拍照並計算轉殖細胞的GFP表達效率（如圖 2）, 及用專屬的ScanLater™ Western Blot 檢測系統來量測CRISPR的剔除效果（如圖 3、4）。

使用 MiniMax™ 300細胞成像系統，研究人員可以在沒有標記的情況下，透過穿透光計算所有細胞總數和表現螢光的轉殖細胞數評估轉殖效率。ScanLater西方墨點檢測系統可以對CRISPR編輯和非編輯細胞中的目標蛋白進行檢測和定量分析。

SpectraMax i3x多功能酵素免疫分析儀，可搭載MiniMax™ 300細胞成像模組及ScanLater西方墨點模組，可用以完整監測從最初的轉染到後續蛋白剔除的確認分析，提供了易於操作且完整的解決方案，可滿足CRISPR基因編輯技術需要對整個過程進行細緻的監控來確保編輯結果。

 

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參考文獻：

Application note: Validate CRISPR-Edited Cells using Imaging and Western Blot Detection on a Microplate Reader

https://www.moleculardevices.com/en/assets/app-note/br/validate-crispr-edited-cells-using-imaging-and-western-blot-detection-on-a-microplate-reader

 

[1] Liang, F et al. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences 95.9 （1998）: 5172-5177.

[2]  Estep, JA et al. Immunoblot screening of CRISPR/Cas9-mediated gene knockouts without selection. BMC molecular biology 17.1 （2016）: 9.

 

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