【HCS應用專輯】在3D器官晶片模型中分析血管新生趨勢
導言
「血管新生」(Angiogenesis)是一個生理上新的微血管發展成一個血流供應系統的過程，在人體生長、發育與傷口癒合中常見、甚至是腫瘤惡化過程中的重要步驟。
血管新生過程可以通過血管和毛細血管的內皮細胞出芽或分裂來實現，血管細胞通過降解細胞外基質對適當的刺激做出反應，隨後誘導內皮細胞增殖和遷移。
目前有部分抗血管新生藥物已投入抑制腫瘤生長療法的研究，而促血管新生分子則可能在心血管、慢性傷口再生應用中具相當的潛力。其中細胞療法是目前最火熱的應用方向之一，如何在體外實驗階段，快速有效地模擬血管新生機制是許多研究者關心的課題。本文將引用MIMETAS公司的OrganoPlatⓇ技術及經驗，作為研究人員的參考依據。
【關鍵技術】
使用ImageXpress Micro Confocal平台 OrganoPlate® 獲取全息影像資料
於CME模組中「重建3D模型」，並以影像視覺化呈現「血管新生出芽」等數值
對血管新生進行「定量評估」，包括芽的數量、總體積和平均螢光強度
在 MIMETAS OrganoPlate 3-lane3,4 細胞晶片板上構建3D 血管新生模型(384 孔)，每個微流控單元由 3x3 個孔組合而成，整盤共 40 個實驗單元 ( 圖 1 )。
每一個微流控單元包含了三個泳道。
膠原 -I 細胞外基質（ECM）膠被填埋入中間的泳道內。被稱為“ 嚮導 ”（phaseguides）的小型壓力屏障將 ECM 凝膠定型，防止其流入鄰近的灌注泳道。
接著，將內皮細胞 ( 原代細胞系，iPSC 誘導 ) 種到灌注泳道上方，並附著於 ECM 膠上。
灌注開始時將 OrganoPlate 放置在搖床上，當細胞增殖時，它們形成內皮微血管。在血管形成後，在母體內皮血管的另一側的底部灌注泳道中加入一系列促血管新生因子。
由此產生的血管新生的化合物梯度會誘導血管新生芽。血管新生芽培養 0-4 天，然後固定，並進行定量分析比對。
【流程&方法】
[固定與染色]
血管細胞和芽用 4% 甲醛固定，用抗 VE-cadherin 的一抗結合樣本，再用二抗 Alexa488（綠色）進行染色標記。肌動蛋白絲用 ActinRed ™ ReadyProbes ™試劑（紅色）染色，細胞核用 Hoechst（藍色）染色。
[拍照]
細胞用ImageXpress® Micro 共聚焦高內涵影像系統 (Molecular Devices) 進行拍照。細胞圖片使用共軛焦模式（60 µm pinhole 轉盤），在 10x 或 20x 水鏡下進行拍照。20x 影像中，採集了 45-58 層的 z-stack 圖層影像，每層 2-4µm 間距。對於 10x 物鏡，採集了 15-25 層圖層，每層4-6 µm 間距。細胞核用 DAPI 通道，血管新生的芽用 FITC 通道，分別在 100 ms 和 400 ms 曝光時間下採集影像。
[影像分析]
影像分析使用了 Molecular Devices的MetaXpress 分析軟體中的客制化分析模組(Custom Module Editor)。參數細節會在結果部分再詳述。簡單來說，選用 Neurite Outgrowth 模組對延伸的血管芽進行辨識，再用 Count Nuclei 模組進行細胞核辨識。然後用“ 最佳匹配連接 ”功能將物體在三維空間的 z 平面之間進行連接。二次分析則是在 Excel 軟體中完成的。
【結果與討論】
血管內皮細胞被種於上泳道中，三天左右形成血管，並顯示出數種不同的生長模式，包括只生長在上層泳道、同時在上層+底層泳道中生成、或者在中間的膠原蛋白膠質層生成（圖 1）。
底部泳道添加生長因子(growth factor)時，可以促進在膠原蛋白中生成血管新生芽，並能進行拍照和分析（圖 2）。
如圖2所示，血管新生芽的代表性影像使用20x水鏡拍照時，固然可以在固體基質中獲得非常銳利和高解析度的細胞影像。但改採用10x物鏡影像時，可以大幅提昇拍照通量，因為每個孔只需要拍攝一個視野和更少的圖層數量。更重要的是，ROI可以將原有血管和新生血管有效區分開來。
【結論】
量化血管新生等複雜生物過程的型態(morphology)變化具有非常重要的意義。而3D模型重建及分析提供了一個更好工具，提供研究者分析更具挑戰性的複雜人類生物學的方法。MIMETAS建構的OrganoPlate+ImageXpress 自動化分析平臺，提供影像和分析的集成式工作流程, 為研究疾病模式和化合物篩選的型態定量分析方法，提供了可借鑒的寶貴經驗。
附錄
Customer Module Editor
適用於 MetaXpress 6.6 以上版本。
Customer Module Editor (客制化分析模組)是適用於複雜度高的型態分析工具。模組本身具備「機器學習」能力(machine learning)，訓練完成後可最用至全盤的影像自動分析，也可以聯合MX Power Core平行運算模組增幅分析速度。
[Tips 專家建議]
本篇方法中，每一層影像中的 FITC 通道都使用了的「高斯擬合」。雖然血管芽通過 Neurite Outgrowth 識別分析模組進行物件分割。在拍攝過程中使用 Region Mask 工具 * 來創建中間膠質層區域，再利用“Keep Marked Objects”進行血管芽識別。因為“Keep Marked Objects”是一個物件導向式圈選方式，ROI之外的物件也可能被選中。
另外，也可以使用「邏輯操作步驟“AND”」進行區分，保留 Region Mask (Region Mask AND Neurite Outgrowth objective) 內的血管芽，而不使用“Keep Marked Objects”。最後，採用“ 最佳匹配連接 ”演算法對各平面上的節點進行三維連接。可輸出的測量值包括體積、直徑和強度。為了提高分析速度，
聯用 MetaXpress® PowerCore ™ 高通量平行分析模組軟體可縮短一半以上分析時間。
* 在影像獲取期間使用自訂創建區域 journal 創建使用者定義的區域，該區域僅包含微流控單元的中間凝膠泳道。該 journal 將定義的區域轉換為用於下游分析的影像圖層。
【參考文獻】
1. Birbrair A, Zhang T, Wang ZM, Messi ML, Mintz A, Delbono O (January 2015). “Pericytes at the intersection between tissue regeneration and pathology”. Clinical Science. 128 (2): 81–93. oi:10.1042/CS20140278. PMC 4200531. PMID 25236972.
2. Birbrair A, Zhang T, Wang ZM, Messi ML, Olson JD, Mintz A, Delbono O (July 2014). “Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis”. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (1): C25-38. doi:10.1152/ajpcell.00084.2014. PMC 4080181. PMID 24788248
3. van Duinen, V., Zhu, D., Ramakers, C. et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.Angiogenesis 22, 157–165 (2019).
4. Trietsch SJ et al (2013) Microfluidic titer plate for stratified 3D cell culture. Lab Chip 3(18):3548–3554.
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